用于盐酸阿霉素增敏的双给药水凝胶体系制备

刘 鸿 鑫，张 强，程 昉*，董 继 程，刘 波，朱 娇 慧

(1.大连理工大学 精细化工国家重点实验室，辽宁 大连 116024；2.大连理工大学 化工学院 药学系，辽宁 大连 116024；3.大连理工大学 生物工程学院，辽宁 大连 116024；4.湖北葛店人福药业有限责任公司，湖北 鄂州 430206 )

0 引 言

乳腺癌是女性中最常见的癌症，占癌症总死亡人数的15%[1]．临床上常用于乳腺癌的抗癌药物是具有高细胞毒性的化疗药物(如5-氟尿嘧啶、吉西他滨、阿霉素、紫杉醇等)[2]．在治疗过程中，乳腺癌细胞容易产生多药耐药性，这主要与膜转运蛋白过量表达有关．其作用机制是将抗癌药物从癌细胞中排出来，大大降低药物对癌细胞的毒性，严重影响治疗效果[3]．因此，对于多药耐药型乳腺癌的治疗，需要设计和制备一种实现抗癌药物增敏的给药体系．

齐墩果酸(oleanolic acid，OA)化学结构如下：

OA是一种天然存在的五环三萜类化合物，在整个植物界中广泛存在．OA及其衍生物具有多种药理活性，例如保肝作用以及抗炎、抗氧化和抗癌活性[4-7]．OA可影响肿瘤发育的不同阶段，阻滞肿瘤细胞周期，是一种癌症化疗的潜在辅助手段．Braga等[8]研究发现，OA可以抑制一种与MDR有关的药物转运蛋白(P-gp)的转运活性，从而增强抗肿瘤活性．使用两种或多种药物的联合化疗可能会提供一些独特的优势，例如发出不同的信号通路，改善治疗效果以及抑制和逆转耐药性[9-11]．盐酸阿霉素(DOX·HCl)化学结构如下：

将OA与DOX·HCl共同递送给药是提高抗癌药物敏感性的新思路．

相较于传统给药方式水凝胶具有生物相容性等多种优点，可以实现局部抗肿瘤药物的递送[12-13]．不同种类的响应型凝胶(如pH和温度等)可以持续或间歇地控制药物释放，明显降低对健康机体的毒性，增强药物对癌细胞的毒性[14]．目前，用于肿瘤研究的共给药水凝胶体系是包埋DOX·HCl和另一种小分子药物(如紫杉醇[15]、米托蒽醌[16]、顺铂[17]、阿司匹林[18]、亚叶酸钙[19]等)．然而DOX·HCl/OA的双给药体系未见报道，可能是因为DOX·HCl与OA的亲疏水性差异过大．因此，有必要在水凝胶中引入疏水基团，通过对其基团种类和密度的调控，实现DOX·HCl/OA的共包埋和共释放．

本实验制备和表征一种新型的聚乙二醇水凝胶材料，通过氧-迈克尔加成反应制备得到聚乙二醇凝胶，实现将亲水性药物DOX·HCl与疏水性增敏剂OA的共同负载和可控释放．经过不同种类醇的修饰，可微调药物共载药释放速率．采用多药耐药型乳腺癌细胞MCF/MDR，考察双给药水凝胶体系的细胞毒性，评价OA与DOX·HCl的协同杀伤作用．

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

试剂六甘醇(EG6，97%)、4-二甲氨基吡啶(DMAP，99%)、齐墩果酸(OA)、5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、半胱氨酸(Cys)购于Aladdin．二乙烯基砜(DVS)购于西亚试剂有限公司．盐酸阿霉素(DOX·HCl)购于Ark．

仪器有傅里叶变换红外光谱仪(6700，ThermoFisher)、平板流变仪(MCR302，Anton Paar)、脱色摇床(TSY-A，Blabotery)、低温恒温箱(FMC-1000，EYELA)、高效液相色谱仪(S3000，Acchrom-Tech)、酶联免疫检测仪(Synergy H1 MFD，BioTek)．

1.2 聚乙二醇水凝胶的制备

将EG6(230 mg，1.0 mmol)、丙三醇(92 mg，1.0 mmol)和DVS(250 mg，2.0 mmol)投入反应瓶中混合，加入DMAP(50 mg，0.4 mmol)搅拌均匀，25 ℃反应2 h形成凝胶．用乙腈洗涤3次，加入一定量超纯水，静置．

1.3 水凝胶的红外表征

将冻干后的水凝胶，使用傅里叶变换红外光谱仪测定其红外光谱，扫描范围为350～7 800 cm-1，分辨率为0.09 cm-1．

1.4 水凝胶中乙烯基砜(VS)残留量的测定

称取25 mg水凝胶置于1 mL的1 mmol/L Cys溶液(pH=8.0)中孵育4 h，取250 μL反应液和50 mL Ellman试剂(10 mmol/L DTNB，pH=8.0)加入2.5 mL反应缓冲液(pH=8.0)中，孵育15 min．使用酶联免疫检测仪测定样品中VS基团残留量(412 nm，0～2 000 μg/mL)．

1.5 水凝胶的封闭

将一定量聚乙二醇水凝胶和2 mL不同醇溶液(甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇)放入24孔板中，并与DMAP孵育12 h．用超纯水清洗3次后，将其存储在超纯水中以进行后续测试．

1.6 封闭后水凝胶的力学性能

用平板流变仪测量水凝胶的储能模量G′和损耗模量G″．将多种醇改性水凝胶放在流变仪板上，将转子(PP25)移动到板间距为1 mm的板上．扫描条件：应变0.1%，频率1 Hz．

1.7 药物包埋

将10%的OA或(和)DOX·HCl溶解在乙腈中并超声处理10 min以制备药物溶液．将200 mg 聚乙二醇水凝胶和2 mL药物溶液加入到24孔板中，并置于37 ℃恒温振荡箱中，以使药物完全装载到水凝胶中．然后干燥并蒸发乙腈．用乙腈和超纯水反复洗涤，以除去未嵌入水凝胶中的药物．通过下式计算水凝胶的载药率(E)：

其中M1是加入的药物总量，M2是药物残留量．

1.8 药物体外释放行为

将载入DOX和OA的水凝胶置于超纯水中，每24 h收集1 mL溶液，再次添加1 mL溶剂以保持相同的体积．取3次平均值．通过下式计算水凝胶的药物释放率(C)：

其中W1为药物在n天的释放量，W2为水凝胶总载药量．

1.9 体外细胞实验

在RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清)中培养多药耐药型人乳腺癌细胞系MCF/MDR细胞，放置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中．每2 d 换一次培养液，待细胞铺满至底部面积的80%时，使用0.2%胰蛋白酶消化传代．

以1×104/孔的密度将MCF/MDR细胞平均铺到96孔板中，培养24 h使细胞完全贴壁．向每孔分别加入浓度为0、0.04、0.08、0.16、0.31、0.63、1.25、2.50 μg/mL的DOX·HCl(每组平行设置5个复孔)，继续培养48 h．使用CCK8试剂盒，用酶联免疫检测仪检测吸光度，从而计算出细胞活性．

以1×104/孔的密度将MCF/MDR细胞平均铺到96孔板中，培养24 h．待其完全贴壁，加入20 μmol/L OA与0、0.04、0.08、0.16 μg/mL的DOX·HCl混合液(每组平行设置5个复孔)，继续培养48 h．使用CCK8试剂盒，用酶联免疫检测仪检测吸光度，从而计算出细胞活性．

在细胞分析仪中，将MCF/MDR细胞以3×104/孔的密度平铺至孔板中，培养24 h待其完全贴壁．将100 μg/mL DOX·HCl和OA包埋至20 mg甲醇修饰的聚乙二醇水凝胶中．将载药后的水凝胶用乙腈和超纯水洗涤，并使用紫外照射灭菌后放入孔板中，观测细胞活性随药物释放后变化以及单载药和共载药对MCF/MDR细胞的影响．

2 结果与讨论

2.1 水凝胶的制备与表征

本文选取EG6和丙三醇作为反应物，DVS和DMAP为添加剂，利用氧-迈克尔加成反应制备中间体，最终吸水溶胀制备PEG水凝胶．为了减少合成的PEG水凝胶上VS基团对细胞的毒性，通过不同醇对水凝胶中VS进行封闭，从而降低细胞毒性．合成路线如图1所示．

图1 聚乙二醇水凝胶合成路线Fig.1 Synthetic route of polyethylene glycol hydrogel

图2 聚乙二醇水凝胶傅里叶变换红外光谱Fig.2 FTIR spectra of polyethylene glycol hydrogel

使用Ellman试剂测定聚乙二醇水凝胶中VS基团的残留量(如表1所示)．选用不同醇对中间体进行封闭．相比于未封闭水凝胶测得VS量为0.236 mmol/g，通过甲醇、乙醇、异丙醇和正丁醇修饰后的水凝胶测得VS基团残留量降低一个数量级，说明残留的VS基团得到了较好的封闭．

表1 不同醇封闭PEG水凝胶中VS残留量Tab.1 Residual VS in PEG hydrogels blocked by various alcohols

2.2 水凝胶力学性能

如图3所示，被不同醇封闭的PEG水凝胶可以调节其力学性能．随着封闭醇链长的增加，储能模量G′也增加．这是因为链的长度增加，水凝胶的内部网络更致密，储能模量增加．损耗模量G″是描述内摩擦损失的能量，可以被看作是由黏性形变转化的热损失．而黏性来自于聚合物链和小分子之间的摩擦．损耗模量先随着链的延长而增加，然后减少．这可能是封闭醇的链长度增加而导致的空间位阻变大，增加了摩擦力．正丁醇的链比其他醇的柔软，链与小分子间的摩擦力较小，因此正丁醇封闭的损耗模量降低．

图3 不同醇封闭PEG水凝胶的弹性模量和损耗模量Fig.3 G′ and G″ of various-alcohol-blocked PEG hydrogel

2.3 体外药物包埋与释放

选取疏水性药物OA和亲水性药物DOX·HCl来检测PEG水凝胶对亲疏水药物的单一释放和共释放性能．将药物包埋于制备的PEG水凝胶材料中，获得不同醇封闭的单载药和共载药水凝胶，其包埋率如表2所示．DOX·HCl载药包埋率明显高于OA载药，是因为DOX·HCl为亲水性药物，其更易包埋于水凝胶中．而DOX·HCl共载药包埋率高于单载药，是因为DOX·HCl的氨基和OA的羧基具有静电作用，提高了包埋率．其中甲醇、乙醇封闭的水凝胶DOX·HCl共载药包埋率分别为86.29%和88.44%，而异丙醇和正丁醇封闭的包埋率分别为85.22%和84.46%，这是因为较长的链长产生了一定的空间位阻作用．

表2 不同醇封闭PEG水凝胶的药物包埋率Tab.2 Encapsulation efficiency of various-alcohol-blocked PEG hydrogel

考察了不同醇封闭PEG水凝胶的药物释放情况，如图4所示．其中图4(a)是DOX·HCl单载药的药物释放曲线，图4(b)为OA单载药的药物释放曲线．从以上结果可以看出，随着醇链长的增加，释放速率减慢．这是因为水凝胶的疏水结构随着醇链长的增加而增大，而醇链长为凝胶的内部结构提供了空间位阻．

图4(c)和(d)分别是水凝胶共载药的双药物释放曲线．与单载药体系相比，共载药体系中OA的释放速率有所加快，结果表明在共释放过程中两种药物相互作用．这可能是由于DOX·HCl的氨基与OA的羧基之间存在静电作用．

(a)DOX·HCl单载药

2.4 体外细胞实验

为了定量考察DOX·HCl对多药耐药型乳腺癌细胞的毒性，选取多药耐药型人乳腺癌细胞系MCF/MDR，利用CCK8试剂盒定量评价了不同浓度的DOX·HCl对MCF/MDR的细胞毒性．加入不同浓度(0，0.04，0.08，0.16，0.31，0.63，1.25，2.50 μg/mL)的DOX·HCl处理48 h 后，细胞的存活率Vc如图5所示，MCF/MDR细胞的存活率存在着一定的浓度依赖关系．随着DOX·HCl的浓度增加，存活率降低，但并没有明显的大量细胞凋亡．使用最大浓度2.50 μg/mL 的DOX·HCl处理后的细胞存活率仍在70%以上，说明MCF/MDR细胞对DOX·HCl存在一定程度的耐药性．

图5 DOX·HCl对MCF/MDR的细胞毒性(n=5)Fig.5 The cytotoxicity of DOX·HCl to MCF/MDR(n=5)

为了考察联合使用OA和DOX·HCl两种药物是否有协同作用，利用CCK8试剂盒评价了在使用不同浓度的DOX·HCl处理的同时加入20 μmol/L的OA后的细胞存活率，其结果如图6所示．单独使用DOX·HCl剂量达到0.16 μg/mL时，细胞存活率约为80%．与单独使用DOX·HCl处理的MCF/MDR细胞相比，加入OA后，细胞的存活率有明显下降，其中，在0.04 μg/mL浓度的DOX·HCl处理后，细胞毒性较大，细胞存活率下降了约20%，OA的增敏效果最为明显．在DOX·HCl浓度较高时，20 μmol/L的OA对DOX·HCl的增敏作用不是很明显．这表明对于多药耐药型人乳腺癌细胞系MCF/MDR，20 μmol/L 的OA对DOX·HCl有着浓度依赖的增敏作用．

图6 DOX·HCl和OA共载药体系对MCF/MDR的细胞毒性(n=5)Fig.6 The cytotoxicity of dual-drug delivery system of DOX·HCl and OA to MCF/MDR (n=5)

使用实时细胞分析仪检测单载药和共载药PEG水凝胶对MCF/MDR细胞活性影响，比较不同给药方式对细胞生长的影响，结果如图7所示．空白水凝胶和OA载药水凝胶对MCF/MDR细胞均无明显作用，细胞的生长曲线与空白对照的细胞生长曲线趋势相近，说明细胞正常增殖，PEG水凝胶具有良好的生物相容性．相比于空白对照、空白水凝胶和OA载药水凝胶，DOX·HCl载药水凝胶和共载药水凝胶的细胞生长曲线在加药后有明显的变化，细胞存活率降低，细胞毒性明显增加．此外还观测到共载药水凝胶在加入到MCF/MDR细胞后就迅速产生明显的细胞毒性．

图7 MCF/MDR细胞在甲醇封闭的不同水凝胶载药体系中的细胞指数

Fig.7 Cell index of MCF/MDR cells in different methanol-blocked hydrogel drug delivery systems

3 结 语

本文报道了一种新型PEG水凝胶的制备方法，用于亲疏水性药物的负载和释放研究．该水凝胶通过不同醇修饰可以调节其力学性能，并对亲水性、疏水性药物均有良好的载药性能，实现了两种性质药物的共载药和共释放．体外细胞实验表明，与单载药水凝胶相比，共载药水凝胶对多药耐药型乳腺癌细胞具有更好的杀伤作用．该共载药水凝胶体系拓展了对多药耐药型乳腺癌的给药方式．