猪流感的实验室诊断研究进展

高原

（辽宁省农业发展服务中心，沈阳 110000）

猪流感（SI）是一种具有高度传染性的重要呼吸道疾病，主要病原体是H1N1、H3N2 和H1N2。SI 感染的诊断目前是基于临床体征观察，经鉴定确认的感染源（PCR，分离）。然而，感染比疾病更频繁。感染猪流感病毒（SIV）通常是亚临床的，典型的症状通常只出现在25%～30%的猪群中。尽管应用程序的反应已经被记录在一系列临床感染中，但应用程序在亚临床感染识别中的潜在用途仍有待确定。亚临床感染猪在猪-猪疾病传播中起着重要作用。此外，这些动物不仅对未感染的动物，而且对农民或屠宰场的工人都是一种危害。

1 血清学诊断

血清学诊断是一种用于检测血清中猪流感病毒抗体的常规传统方法，由于同属A 型流感病毒，其病毒皆有血凝特性，主要方法过程与禽流感血清学检测基本相同，包括HA-HI 试验、酶联免疫吸附试验、琼脂凝胶扩散、中和试验、神经氨酸酶抑制试验等。其中HA-HI 试验与酶联免疫吸附试验由于其操作相对简单省时，经常用于大量样品的实验室检测。

1.1 血凝- 血凝抑制试验HA- HI

SI 病毒表面由HA 基因编码的HA蛋白具有识别和吸附红细胞表面受体的特定结构，SI 病毒抗体能与该结构结合抑制其与受体红细胞结合，由此而产生这种针对流感病毒凝血特性的SI 病毒检测方法。研究表明，HA-HI 试验对SIV 的分型是可行的，但由于流感病毒的变异性，要最终确定病毒亚型仍需要进一步的分型试验。

1.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）

酶联免疫吸附试验是目前应用范围相对最广的SIV 检测手段，已经建立如双抗体夹心，间接法等多种试验方法。实践表明，该方法是一种应用于群体检测SIV 的有效检测方法，利用酶来对抗原抗体进行标记，通过显色反应来判断结果。具有敏感性高，可检测抗原和抗体，可标准化检测，结果简单易于分析的特点。

1.3 神经氨酸酶抑制试验（NI）

NI 试验主要被用来对SIV 表面NA蛋白亚型进行分型的检测，与HA-HI 试验一同可最终鉴定出被检SIV 病毒的亚型。1983 年常量NI 法得以改进，建立了微量NI 法，该方法已被美国国家兽医研究所定为确定鉴别NA 抗体的常规方法。

1.4 中和试验（SN）

通过中和试验鉴定或者滴定猪流感病毒时，通常选用对流感病毒相对敏感的组织培养细胞或鸡胚。中和试验的特异性和敏感性都相对较强，与病毒表面抗原相配时，特别是已吸附宿主细胞的病毒，才会有明显的实验现象结果产生。由于试验时间较长，操作繁杂等原因，并未被大量应用到实验室SIV 检测中。

1.5 琼脂糖凝胶扩散试验（AGID）

AGID 是一种在琼脂糖凝胶中进行的SIV 抗原抗体沉淀反应，具有方便快捷并且不易发生变异的特点。试验所用的抗原或抗体必须经过纯化方可使用，否则结果易出现假阳性。该试验敏感性相对较差，经过改进后的免疫双扩散实验对此不足加以调整，并相比之前的AGID 试验更加便捷省时。国内已建立了相应的诊断技术及试剂盒。

2 分子生物学诊断

血清学方法由于其操作复杂繁琐，用时较长，对实验环境因素敏感导致结果的重复性无法保证，但此类传统方法在初步分离鉴定SIV 病毒上还是发挥着一定作用。随着分子生物学的不断发展，利用分子生物学手段快速诊断SIV已经成为了最为重要的诊断途径。

2.1 聚合酶链式反应（PCR）

PCR 已广泛应用于各类实验室的流感病毒诊断当中，其检测快速，结果准确，检测敏感度可达pg 标准。该方法是一种DNA 体外扩增技术，最早于1985 年由Maliss 建立，且于1987 年实现了自动化实验，此项技术的建立是分子生物学史上的重要里程碑，加快了分子生物学技术的发展脚步。临床检测中，待检病原通常是病毒RNA 分子，因此人们通过反转录方式先将其翻译成cDNA，也就是RT-PCR 技术。国内PCR与RT-PCR 的检测技术与试剂盒的建立也已经发展相对成熟，检测见过较为准确稳定。

2.2 荧光定量PCR 反应

荧光定量PCR 反应是一种在PCR定性技术基础上逐渐发展起来的PCR定量反应。将荧光团加入到反应体系当中，通过萤光信号的积累对整个PCR 反应进行实时监测。它有效地解决了常规PCR 产物污染问题，可以对其实模板准确定量，且自动化程度相对较高，准确性更强，并具有实时性。不可否认，其成本较普通PCR 高出许多，但由于其诸多优点，目前仍较为广泛的应用于医学与生物学研究领域。另外，该方法还可以同时进行多种萤光信号的识别，因此可同时检测多种疾病，为疾病的全面快速诊断提供重要的依靠。经临床实践表明，该方法的建立奠定了猪流感病毒早期诊断，定量分析的基础。

2.3 依赖核酸序列的扩增法（NASBA）

依赖核酸序列的扩增法是一种扩增RNA 分子的新技术，一对引物作为引导，作连续均匀速度的恒温体外酶促反应，可在2 小时左右扩增模板RNA 至109 倍，与传统PCR 相比更加高效稳定，准确率高。目前国内尚无NASBA 用于猪流感病毒检测的相关研究报道，但由于其准确高效的特性，对于其应用于A 型流感病毒的检测仍有着相当广泛的前景。

2.4 基因芯片检测技术

基因芯片检测法是指在支持物上固定好大量的探针分子后，同标记好的样品杂交，以杂交之后信号强弱来获得待检测分子序列等相关信息。该技术污染少，高通量化，可同时进行多组基因的检测，因而较为广泛的应用于基因表达检测，基因突变型检测以及疾病诊断与检测等多项研究中。国内对于基因芯片引物的设计方面，不同检测方法的建立已经有十分丰富的成果，对于SI 防控也有着十分积极的意义。