液相色谱—串联质谱同时检测肉类中11种鼠药残留

钟菲菲

徐文泱2

杨 韵1

谢芳云1

宋 阳2

黄 燕2

(1. 长沙市食品药品检验所国家酒类产品质量监督检验中心，湖南 长沙 410000；2. 湖南省食品质量监督检验研究院食品安全监测与预警湖南省重点实验室，湖南 长沙 410017)

鼠药是减轻鼠害、保证粮食产量的有效手段之一[1]。随着科技的发展，杀鼠药逐渐由剧毒向低毒性转变[2]，抗凝血型杀鼠剂则是近年来被广泛使用的杀鼠药类型[3]。这些化合物衍生自无水香豆素核(如杀鼠灵、杀鼠醚、溴敌鼠)和茚满二酮核(如敌鼠、杀鼠酮、异杀鼠酮)[4]。当抗凝血灭鼠药进入人体时，维生素K环氧化物还原酶负责在合成凝血因子II、VII、IX、X中作为辅因子被消耗后从维生素K环氧化物中还原被还原的维生素K。此外，抗凝血灭鼠剂可直接破坏毛细血管壁，引起广泛的内脏出血，导致内出血甚至死亡[5-6]。

抗凝血类鼠药种类众多，而目前尚未制定有关食品中鼠药测定的标准方法，且其检测存在盲区和死角。因家禽可能误食含有鼠药的饵料使鼠药进入食物链而导致中毒事件，因此有必要建立针对此类物质的高精度、高通量、多残留检测技术。

目前，鼠药残留的检测方法主要有化学显色法[7]、分光光度法[8-9]、薄层色谱法[10]、高效液相色谱法[11-14]和气/液相色谱—串联质谱法[15-19]。其中前3种方法的检测准确度低，假阳(阴)率高，而高效液相色谱法的适用性强，但遇到干扰较大需进行定性鉴别时，液相色谱—串联质谱则更具优势。鼠药检测的报道多以体液为研究基质[20-22]，涉及食品中鼠药的检测较少，且食品基质多为植物源性食品[23-24]。朱峰等[25]发现采用QuEChERS方法可得到良好的净化效果，并通过超高效液相色谱-串联质谱法建立了辣椒酱、面粉、醋和酱油中的杀鼠醚、杀鼠灵、敌鼠、氯敌鼠、溴敌隆、大隆、杀它仗、鼠得克、克灭鼠、氯杀鼠灵的检测方法，平均回收率为72.6%～112.0%。

试验拟选取氯杀鼠灵、鼠得克、鼠敌、双香豆素、溴敌隆、氯鼠酮、溴鼠灵、杀鼠酮、杀鼠醚、华法林和氟鼠酮11种常见抗凝血性鼠药(见表1)，以肉类为研究基质，选择合适的萃取净化方式建立液相色谱—串联质谱分析方法，以利于食品安全监管工作的全面展开，为食品应急突发事件的妥善处理提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生鲜猪尾：市售；

水：GB/T 6682规定的一级水；

乙腈：色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司；

氯杀鼠灵、鼠得克、鼠敌、双香豆素、溴敌隆、氯鼠酮、溴鼠灵、杀鼠酮、杀鼠醚、华法林、氟鼠酮：100 mg/L，美国A Chemtek公司；

表1 11种鼠药的基本信息表

QuEChERs萃取盐包(6 g MgSO4，1.5 g NaOAc)：日本岛津公司；

其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

液相色谱—质谱仪： TSQ Quantum ultra型，美国赛默飞世尔科技公司；

分析天平：ME204E型，瑞士梅特勒仪器有限公司；

多管旋涡混合器：945066数显型，美国Talboys公司；

多通道平行浓缩仪：MV5型，北京莱伯泰科仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制 分别准确移取1 mL鼠药残留标准溶液于容量瓶中，定容至10 mL。标准系列溶液现配现用，溶剂为甲醇。

1.3.2 样品前处理

(1) 提取剂：分别选择丙酮、乙酸乙酯、乙腈、丙酮+二氯甲烷(V丙酮∶V二氯甲烷=3∶7)进行优化，选择最佳提取剂。

(2) 净化剂：萃取盐包(6 g MgSO4，1.5 g NaOAc)。

(3) 净化方法：选择QuEChERs萃取盐包、QuEChERs净化盐包、中性氧化铝SPE小柱、硅藻土SPE小柱4种净化方式，测定平均回收率，并以直接提取不净化的样品作参照。同时，选取不同品牌不同规格的以PSA为核心成分的QuEChERs净化盐包如SINQuEChERS(2 g Na2SO4+0.6 g MgSO4+90 mg PSA+15 MWCNTs)、Wonderpak QuEChERS SPE(900 mg MgSO4+150 mg PSA)和Cleanert MAS-Q(50 mg PSA+50 mg PC+50 mg C18+150 mg MgSO4)进行净化。

(4) 最终优化方法：精确称取2.000 0 g样品，加入乙腈20 mL，无水硫酸钠1 g，涡混振荡30 min，离心取上清液，重复振荡，合并上清液，50 ℃氮吹浓缩至10 mL，加入QuEChERs萃取盐包振荡1 min，以2 mL甲醇复溶，有机滤膜过滤，上机检测，计算平均回收率。

1.3.3 仪器条件

(1) 液相色谱条件：色谱柱为Hypersil Gold C18(100 mm×2.1 mm，3.0 μm)；流速0.2 mL/min；流动相A为0.05 mol/L乙酸铵水溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱条件见表2。

表2 梯度洗脱程序

(2) 质谱条件：电喷雾电离；正离子扫描；多反应监测(MRM)；喷雾电压2 500 V；传输毛细管温度500 ℃；驻留时间34.712 s，质谱参数设置见表3。

表3 多反应监测模式下11种鼠药的质谱参数

1.3.4 基质效应评价 选取鸡肉、牛肉以及猪尾配制空白基质标准曲线，分别以空白基质和甲醇配制系列标准曲线，以空白基质中标准物质的峰面积和试剂中标准物质的峰面积的比值考察基质效应。

1.3.5 线性范围和检出限 配制11种鼠药残留质量浓度分别为0.2，0.4，0.8，2.0，4.0，8.0，16.0，32.0，100.0 μg/L的系列标准溶液，以所述仪器条件进样。

1.3.6 回收率和精密度 选取3种畜禽肉类进行加标回收率试验。加标量为0.1，0.2，1.0 μg/kg，样品均质后，加入不同体积的标准溶液，并静置24 h，按前处理方法提取净化后上机测试。

1.3.7 数据处理 采用SPSS 23软件进行数据统计分析，结果以3次平行试验的平均值表示。

2 结果与分析

2.1 提取剂优化

试验表明，当以乙腈为提取剂时，样品回收率最高。这可能是由于丙酮和二氯甲烷易萃取出大量脂类，用其对猪尾中残留的鼠药进行提取时，离心管中会出现明显的呈凝胶固态的高蛋白，无法进行进一步的净化。而乙酸乙酯对于中等脂类的食品基质如牛奶、甲壳类和肉类的萃取更具选择性，但对于高脂肪食品则需要可溶解、渗透脂肪的非极性溶剂来萃取聚集在基质中的高亲脂性鼠药，此时可能要选用凝胶色谱进行净化，而这种仪器价格昂贵，较难满足基层实验室对安全风险监管的要求。乙腈不溶于水，且盐类的加入有利于更多的鼠药进入有机溶剂层。因此选择乙腈为最终的提取剂，且提取次数固定为2次。

2.2 净化条件的优化

试验发现，使用含有PSA的QuEChERs净化后，鼠药回收率最低，可能是由于PSA填料对鼠药有极好的吸附作用，上清液中的鼠药均附着在PSA上而溶液中几乎无残留。采用中性氧化铝及硅藻土SPE小柱净化后，鼠药回收率基本<50%，而未净化的回收率普遍>110%，说明未净化可能会带来干扰，影响结果的准确性。因此选择萃取盐包为净化试剂。

2.3 仪器条件优化

由图1可知，采用1.3.3的液相色谱条件可在10 min内分离所有分析物，分离度佳且峰形良好，说明4.0 μg/L甲醇标准溶液的分离效果及响应值最高。

2.4 基质效应

由表4可知，11种鼠药的基质效应为0.92～1.09，说明基质对测定结果的影响较小，因此在配制标准曲线时用甲醇试剂即可。

图1 11种鼠药的MRM色谱图

2.5 线性范围和检出限

由表5可知，11种鼠药残留在0.2～100.0 μg/L范围内线性方程相关性良好，根据GB/T 27404—2018《实验室质量控制规范食品理化检测》获得定量限为0.1 μg/kg。

2.6 回收率和精密度

由表6可知，鼠得克、双香豆素、溴敌隆、杀鼠醚、氯鼠酮、华法林、杀鼠酮、氯杀鼠灵、鼠敌、溴鼠灵和氟鼠酮11种鼠药的回收率为60.2%～119.3%，符合GB/T 27404—2008的技术参数要求。而且所有鼠药检测结果的精密度均<20%。

表4 11种鼠药在不同基质中的基质效应

表5 11种鼠药残留的线性方程和相关系数

表6 肉中11种鼠药残留的回收率和精密度

续表6

3 结论

建立了同时测定动物源性食品中氯杀鼠灵、鼠得克、鼠敌、双香豆素、溴敌隆、氯鼠酮、溴鼠灵、杀鼠酮、杀鼠醚、华法林和氟鼠酮11种鼠药的液相色谱串联质谱法。结果表明，试验方法在0.2～100.0 μg/L范围内标准物质线性方程相关系数可达到0.99，当加标量为0.1，0.2，1.0 μg/kg 时的回收率为60.2%～119.3%，该残留方法的开发有利于填补监测死角，为处理食品应急突发事件提供技术支持。后续可进一步扩大食品基质种类，建立高通量的检测方法，完善方法的适用性、科学性和可行性。