BMP-2对BMSCs放射损伤的保护作用及机制的初步研究

唐子豪 宗春琳 张维文 赵路 田磊 李德超

大约75%头颈癌患者需行放射治疗［1］，在头颈部放疗并发症中，放射性颌骨骨坏死（ORNJ）是最难治的远期并发症之一。ORNJ可导致皮肤和黏膜溃烂、死骨暴露等，给患者带来巨大痛苦。目前ORNJ发病机制不清、仍缺乏有效的预防及治疗方法。针对ORNJ发病机制，寻找有效的预防及治疗方法，具有重要意义。

自2004年Delanian等［2］提出放射诱导组织萎缩观点后，近些年来，越来越多学者认同ORNJ是一种放射诱导的纤维化疾病［3］。大量文献及本课题前期研究发现，放疗后颌骨局部骨髓间充质干细胞（BMSCs）受损，导致其成骨分化能力下降，并出现肌成纤维细胞（MFB）表型、向成纤维化方向分化，这有可能是导致ORNJ的重要发病机制之一［4－6］。

BMP-2的成骨能力得到广泛公认［7］，放射线可抑制BMP-2的表达［8］，外源性使用BMP-2可增强放射性颌骨骨坏死的成骨能力［9］。在胰腺等其他器官纤维化疾病的研究中，发现BMP-2有减轻纤维化的作用并且这一作用可能与抑制TGFβ1/Smads通路的表达有关［10］，但是在 ORNJ中，BMP-2是否可以抑制放射损伤后BMSCs向成纤维方向分化，尚未见报道。本研究通过检测放射损伤的BMSCs使用BMP-2干预后，成纤维相关蛋白分子的变化情况，探究BMP-2对放射线损伤的 BMSCs的保护作用，并初步探讨 TGFβ1/Smad通路在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 大鼠BMSCs来源与培养

BMSCs原代细胞取自于2～3周龄的SD大鼠，麻醉后，无菌条件取出胫骨，使用含有10%胎牛血清α-MEM培养液冲洗骨髓，于培养皿中培养至3～6代用于实验。

1.2 大鼠BMSCs鉴定

成骨与成脂分化诱导：培养细胞加入成骨诱导液诱导21 d后，进行茜素红染色。培养细胞加入成脂诱导液诱导18 d后，进行油红O染色。

细胞表面抗体检测：选取长势良好、形态均一的P4代 BMSCs，加入 CD29-PerCP、CD45-FITC、CD90-PE-CyTM7单克隆抗体，制成单细胞悬液后使用流式细胞仪检测。

1.3 细胞模型建立

采用课题组前期的建模方法进行［11］。使用放射线对BMSCs进行照射，放射源为咸阳第二一五医院放疗科CX576型放射治疗机（VARIAN，美国），射线性质为高能X射线，设置射线能量为6 MeV，剂量率为4 Gy/min，单次剂量为 4 Gy。

1.4 细胞的分组、诱导

为选出BMP-2最佳剂量，对放射后BMSCs分别使用25、50、100、250 ng/mL的 BMP-2，作用 7 d，并使用 Western blot检测其 α-SMA的表达［12］。

将BMSCs分为对照组、放射组、BMP-2组、BMP-2＋头蛋白（Noggin）组。对照组不接受放射线照射；放射组使用4 Gy放射线照射；BMP-2组在使用4 Gy放射线照射后使用100 ng/mL BMP-2作用7 d；BMP-2＋Noggin组在BMP-2组基础上增加200 ng/mL的BMP-2拮抗剂Noggin（PrimeGene，上海）。使用Western Blot检测各组α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Col-Ⅲ、TGF-β1、Smad2/3、pSmad2/3的表达；使用免疫荧光检测Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表达；使用RT-PCR检测α-SMA的表达。

1.5 统计学方法

用GraphPad Prism进行数据分析，student-t检验进行统计学分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 BMSCs的鉴定

培养的BMSCs（图1A），成脂诱导后脂肪细胞形成，累计脂滴呈串珠状，油红O染色呈鲜红色（图1B）；成骨诱导后可见茜素红染色矿化结节呈红色（图1C）；流式细胞仪检测结果显示BMSCs中CD29、CD90表达阳性率分别为100%、99.9%，而 CD45阳性率0.8%（图1D）。

A：BMSCs形态（×40）；B：油红O染色（×200）；C：茜素红染色（×40）；D：流式细胞仪检测图1 体外培养的BMSCs的鉴定A：BMSCs morphology（×40）；B：Oil red O staining（×200）；C：Alizarin red staining（×40）；D：Flow cytometry analysisFig 1 Identification of in vitro cultured BMSCs

2.2 BMP-2作用剂量测定

Western blot检测不同浓度BMP-2作用后放射损伤BMSCs中α-SMA的表达，发现100 ng/mL的BMP-2作用后，α-SMA表达量最低，且与对照组相比，P＜0.05（图 2）。

图2 BMP-2对BMSCs中α-SMA表达的影响Fig 2 The effect of BMP-2 on α-SMA expression in BMSCs

2.3 成纤维相关蛋白分子的表达变化

Western blot结果表明，放射组BMSCs中α-SMA、Col-Ⅲ表达量高于对照组，BMP-2组表达量与放射组相比显著降低（P＜0.05）；BMP-2＋Noggin组表达量与放射组无统计学差异（图3）。

图3 Western blot检测各组细胞中α-SMA和Col-Ⅲ的表达Fig 3 Western blot analysis of α-SMA and col-Ⅲ expression in BMSCs of the groups

免疫荧光方法检测各组Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表达，结果显示放射组Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的表达均显著高于对照组（P＜0.01），BMP-2组 Col-Ⅰ和 Col-Ⅲ的表达显著低于放射组（P＜0.01）、与对照组相比无统计学差异（P＞0.05），BMP-2＋NOGGIN组Col-Ⅰ和 Col-Ⅲ的水平显著高于BMP-2组（P＜0.01）、而与放射组相比无统计学差异（P＞0.05）（图 4）。

图4 免疫荧光法测量Col-Ⅰ和Col-ⅢFig 4 Immunofluorescence for measuring Col-Ⅰ and Col-Ⅲ expression in BMSCs of the groups

RT-PCR结果表明，放射后 α-SMA扩增倍数升高，BMP-2组α-SMA扩增倍数较放射组显著降低（P＜0.05），BMP-2＋NOGGIN组 α-SMA扩增倍数高于BMP-2组（图 5）。

图5 RT-PCR法测量各组BMSCs中α-SMA的表达Fig 5 α-SMA expression in BMSCs of the groups examined by RT-PCR

2.4 TGF-β1/Smad通路的表达变化

Western blot检测结果表明，如图6所示，BMP-2组中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3表达量均较放射组降低（P＜0.05），BMP-2＋Noggin组中 TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3表达量与放射组无统计学差异（P＞0.05）（图6）。

图6 Western blot法检测各组BMSCs中TGF-β1/Smad相关蛋白表达量Fig 6 Western blot analysis of TGF-β1/Smad pathway related protein expression in BMSCs of the groups

3 讨 论

ORNJ是头颈癌患者放疗后常见的一种远期并发症，治疗棘手、发病机制不清，目前大量的研究认为，ORNJ是一种放射诱导的纤维化疾病，与放射损伤后局部组织内干细胞受损、成骨能力下降以及纤维化基质堆积有关。有研究表明，应用BMP-2对ORNJ具有一定的治疗作用并且与促进ORNJ病变组织内成骨分化有关，而BMP-2在一些其他纤维化疾病如胰腺纤维化等中，可抑制纤维化的形成，从而对纤维化疾病具有一定的治疗作用［10］。但是，BMP-2对ORNJ的治疗是否与抑制纤维化有关，目前尚未见研究报道。因此，本研究通过建立BMSCs放射损伤模型，检测BMP-2作用后纤维化相关分子以及TGF-β1/Smads通路的表达变化情况，以明确BMP-2对放射损伤BMSCs成纤维分化的抑制作用，并初步探讨其可能的机制。

BMP-2在肺等其他组织纤维化疾病中能够抑制α-SMA的表达，减轻纤维化［13］。本研究发现，使用BMP-2作用于放射后 BMSCs，可显著降低 α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表达，表明BMP-2可抑制放射损伤BMSCs向成纤维化分化、减少放射后细胞外基质的堆积，这可能是BMP-2治疗ORNJ的重要机制之一。

近年越来越多的研究表明，TGF-β1在纤维化进程中起到重要作用，已成为公认的器官纤维化治疗靶标［14］。有研究表明，在肾的炎症、纤维化反应中，BMP-2可通过抑制Smad2/3磷酸化而拮抗TGF-β1的作用，最终抑制肾脏纤维化［15］。本研究发现，BMP-2可明显抑制放射损伤BMSCs中TGF-β1及p-Smad2/3的表达，表明BMP-2抑制放射损伤BMSCs的成纤维化能力，可能与TGF-β1/Smad途径相关。

通过本研究，发现BMP-2可抑制放射损伤BMSCs中的纤维化相关分子、TGF-β1及其下游分子的表达。由此推测，BMP-2除了可增强放射损伤后BMSCs的成骨分化能力，还可能通过抑制TGF-β1/Smad信号通路从而减轻其向成纤维方向分化。本研究进一步阐明了BMP-2在ORNJ治疗中的机制，可为提高BMP-2对ORNJ的治疗效果提供理论依据。仅管BMP-2在体外培养的放射损伤BMSCs中具有抗纤维化作用，但BMP-2在ORNJ组织中抗纤维化的具体机制并不清楚，还需要通过更多的体内外实验进一步研究BMP-2在ORNJ中的抗纤维化作用。