基于叶片解剖结构的京津冀主栽板栗品种抗旱性评价

郭 燕 张树航 李 颖 张馨方 王广鹏

(河北省农林科学院昌黎果树研究所，河北秦皇岛 066600)

板栗(Castanea mollissimaBl.)是我国主要的坚果树种，广泛分布于我国各地山区。其中，京津冀是我国板栗的优势主产区，栽培面积占全国总面积的20%以上，板栗已成为京津冀山区农民经济收入的重要支柱树种。干旱一直是危害京津冀板栗生产的主要因素之一[1]。因此准确评价品种抗旱性，筛选利用抗旱性强的品种，对实现京津冀山区栗园高产优质生产具有重大意义。

抗旱性是指植物在干旱环境中生长、繁育或生存的能力，以及在干旱解除后迅速恢复的能力[2]。植物的抗旱性是在形态结构、生理和生化等各方面综合表现的遗传特性[3]。生理生化指标易受环境因子短暂变化的影响而表现出异常的变化，而植物的形态及解剖结构是在长期特定环境条件下适应并演化的结果，不会随环境因子的暂时改变而发生较大的变化[4－5]。叶片是植物直接暴露于空气中面积最大的器官，在外界生态环境的长期影响下，通常会形成多种抗旱适应形态，影响植物的光合特性及水分运输和利用系统[6－7]。相关研究表明，植物的抗旱性与叶片厚度、上下表皮细胞厚度、栅栏组织厚度、栅海比、组织结构紧密度、气孔密度等呈正相关，与海绵组织厚度、组织结构疏松度等呈负相关[3，8－13]。叶片解剖结构指标已被广泛应用于山核桃(Carya cathayensis)[4]、杨树(PopulusL.)[6]、苹果(MalusMill.)[11]、葡萄(Vitis vinifera)[14]、沙棘(Hippophae rhamnoidesLinn.)[15]等多种林果树种的抗旱性鉴定。另外，叶片保水力也是重要抗旱性鉴定指标，具有测定方法简单、重复性好、样本容量大的优点，在造林树种[16]、楸树[17]和烤烟[18]等抗旱性鉴定中已取得较好的应用效果。

目前，有关板栗品种抗旱性鉴定的研究多集中于生理指标筛选和少数几个品种抗旱性比较。李钧[19]研究了水分胁迫后板栗苗木丙二醛－脯胺酸－保护酶活性的变化。郑龙等[20]和武燕奇等[21]分别通过叶片电导率和解剖结构及气孔特征指标比较了7 个和10个板栗品种的抗旱性。抗旱性是多个性状综合作用的结果，需要根据多个性状综合评价，而且植物的抗旱性由于地域和采用方法不同所得结果也有所不同。京津冀地区气候环境类似，板栗栽植品种一直通用，而有关京津冀栽植品种抗旱性鉴定、筛选方面的研究，至今鲜见报道。本研究选取京津冀板栗产区的36 个主栽品种，通过对其叶片相关抗旱解剖结构、气孔和叶柄叶脉特征的筛选分析，综合评价各品种抗旱性强弱，旨在为京津冀主栽板栗品种的生产规划和高效利用创新提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

河北省农林科学院昌黎果树研究所板栗种质资源圃，地处118°51′E，39°53′N，属中国东部季风区暖温带半湿润大陆性气候。试验地2018年7月平均气温25.9℃，1月最低平均气温－5.5℃，年平均气温11.9℃，日较差10.3℃，≥10℃年积温4 410℃；年均降水量478.7 mm，年均相对湿度59%，无霜期187 d；年日照时数2 719.7 h；海拔20 m，土壤类型为沙壤土。

1.2 试验品种

分别选取在京津冀板栗栽培面积超万亩的品种为试验对象，共36 个(表1)，所有试验品种均是在2004年统一嫁接于3年生燕山早丰实生砧木上，株行距4 m×4 m，各品种植株修剪、肥水及病虫害防控等管理措施一致。

1.3 试验材料

2018年7月15日，选取每个板栗品种生长势基本一致的3 株，选择每株东向冠层外围中部1年生营养枝3 条，在其上选取第7～第9 节位健康、成熟叶片3 片，共27 片，以密封袋密封后置于冰盒带回实验室，随机选取10 片立即用于叶片保水力的测定；选取10片立即用于叶柄、叶脉、气孔特征的观测；随机选取5片用锡箔纸平展包好，液氮速冻后放入－80℃冰箱用于叶片解剖结构观测。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 叶片保水力的测定 叶片保水力的测定采用离体叶片自然失水法[18]。

1.4.2 叶片解剖结构的观测 采用冷冻切片法制作切片，在Olympus BX51 光学显微镜(日本奥林巴斯)下进行观察拍照。每品种1 个叶块选取完整平展的1个切片，共5 个(5 次重复)，每个切片拍3 个视野。使用SPOT 图像测量软件测量并计算16 项叶片内部解剖结构指标:叶片厚度(leaf thickness，LT)、上表皮角质层厚度(cuticle thickness of upper epidermis，CTU)、上表皮细胞厚度(thickness of upper epidermis cell，TU)、第一层栅栏组织细胞密度(the first layer of palisade tissue cell density，FPD)、第一层栅栏组织细胞长度(the first layer of palisade tissue cell length，FPL)、第二层栅栏组织细胞长度(the second layer of palisade tissue cell length，SPL)、栅栏组织厚度(thickness of palisade tissue，TP)、海绵组织厚度(thickness of spongy tissue，TS)、下表皮细胞厚度(thickness of lower epidermis cell，TL)、下表皮角质层厚度(cuticle thickness of lower epidermis，CTL)。参照徐扬等[11]的方法计算栅海比(P/S)、叶片组织结构紧密度(tightness of leaf structure，TLS)和叶片组织结构疏松度(looseness of leaf structure，LLS)。

1.4.3 叶片气孔大小和密度的观测 参考指甲油印迹法[4]制片，在Olympus BX51 光学显微镜下观察拍照，每品种制作5 个装片，每个装片拍3 个视野。用SPOT 图像测量软件对气孔长度(stoma length，SL)、气孔宽度(stoma width，SW)、气孔密度(stoma density，SD)进行测量统计。参照郭学民等[22]方法计算气孔周长(stoma perimeter，SP)和单位面积气孔总周长(the total stoma perimerer per unit area，SPA)。

1.4.4 叶柄及叶脉的观测 先使用惠普扫描仪在200 分辨率模式下将每个叶片扫描成图片，每个品种扫描10 个叶片(10 次重复)，然后使用万深LA-S 叶片多功能图像分析软件分析图片，得到叶柄长(petiole length，PL)、叶柄宽(petiole width，PW)、叶柄长/宽(L/W)、叶片长(leaf length，LL)4 项指标，叶脉间距(spacing length of veins，VSL)计算公式为:VSL＝LL/单边叶脉数＋1。

1.5 数据处理与分析

运用Excel 2010 和SPSS 20.0 对数据进行处理和方差及相关性分析，采用主成分分析法筛选典型指标并确定其权重，运用隶属函数法结合各典型指标权重综合计算36 个板栗品种抗旱性度量值(D值)[23]。参照何伟[24]的方法，依照D值将板栗抗旱性分为5 级:0.60～0.80 为高抗(high resistance，HR)，1 级； 0.50～0.59 为抗(resistance，R)，2 级；0.30～ 0.49 为中抗(middle resistance，MR)，3 级；0.20 ～ 0.29 为低抗(lower resistance，LR)，4 级； 0 ～ 0.19 为不抗(susceptible，S)，5 级。

2 结果与分析

2.1 叶片保水力比较

叶片保水力是叶片在离体状态下保持原有水分的能力，叶片保水力越强，抗旱性越强。36 个板栗品种叶片保水力由大到小排列如图1所示。各品种叶片保水力在20%～70%之间，其中燕宝、烟青、大青裂、烟泉、燕丽、京暑红、燕昌、燕红和良乡1 号的叶片保水力值均低于30%，抗旱性较差；燕龙、燕晶、燕宽和燕金均高于60%，抗旱性较好。

图1 36 个板栗品种离体叶片保水力Fig.1 The water retention capacity of excised leaves of 36 chestnut cultivars

2.2 叶片结构特征比较

2.2.1 叶片厚度比较 叶片厚度常作为植物抗旱性评价指标之一。由表1可知，36 个板栗品种叶片厚度之间均存在极显著差异(P<0.01)，且变异系数也较高(10.56%)，说明叶片厚度适用于板栗抗旱性分析。各品种叶片厚度变化范围为150.19～240.14 μm，最厚(燕龙)比最薄叶片(燕宝)厚59.89%，其中燕宝和烟青叶片厚度较小，分别为150.19 和151.51 μm，燕金、燕宽、燕晶和燕龙的叶片厚度相对较大，分别为205.78、209.75、209.33 和240.14 μm。

表1 36 个板栗品种叶片厚度与表皮特征Table 1 Leaf thickness and epidermis characters of 36 Chestnut cultivars

2.2.2 叶片表皮特征比较 由图2可知，板栗叶片均表现出上表皮茸毛较少、下表皮茸毛较密。由图3可知，表皮由单层细胞构成，具有角质层，上、下表皮细胞均呈长方形，上表皮细胞明显大于下表皮细胞。由表1可知，各品种叶片上表皮角质层厚度均较下表皮大，上表皮角质层厚度在4.40～6.45 μm 之间，燕丽最薄，东陵明珠最厚；下表皮角质层厚度在1.41～3.26 μm之间，怀丰最薄，燕丰最厚；方差分析结果表明，上表皮角质层厚度和下表皮角质层厚度在各品种之间无显著差异，不适用板栗抗旱性分析。各品种叶片上表皮均较下表皮细胞厚度大，上表皮细胞厚度在20.61～36.05 μm 之间，东陵明珠最薄，京暑红最厚；下表皮细胞厚度在3.78～7.33 μm 之间，迁西早红最薄，燕龙最厚；方差分析表明，上表皮细胞厚度和下表皮细胞厚度在各品种之间差异达到极显著水平(P<0.01)，说明这两项指标适用于板栗抗旱性分析。

图2 板栗叶片表面茸毛特征Fig.2 The leaf pubescence characteristics of chestnut

图3 板栗叶片厚度和解剖结构的显微观察Fig.3 The microscopic observation of leaf thickness and anatomical structure of chestnut

本研究中，各品种叶片上表皮均未见气孔分布，而下表皮散生大量气孔，气孔明显凸起，为椭圆形或圆形。气孔器由2 个肾形保卫细胞构成，形状相似(图4)。由表1可知，气孔长度、宽度、密度和单位面积气孔总周长在各品种间均有极显著差异(P<0.01)，说明这些指标适用于板栗抗旱性分析。36 个品种的叶片气孔长度变化范围为16.86～26.11 μm，平均22.57 μm，最大值较最小值大54.88%；气孔宽度介于15.96～23.30 μm，平均21.18 μm，最大值较最小值大46.05%；气孔密度介于772.97～1 281.47 个·mm－2，平均964.44 个·mm－2，最大值较最小值大65.79%；单位面积气孔总周长介于32.56～61.72 mm，平均43.58 mm，最大值较最小值大89.56%。

图4 板栗叶片下表皮气孔密度差异Fig.4 Difference of stomatal density in lower epidermis of chestnut leaves

2.2.3 叶肉解剖结构特征比较 由图3可见，板栗叶片栅栏组织有2～3 层细胞，长圆柱状，垂直于上表皮细胞，并排列紧密，而海绵组织细胞形状多样，排列疏松，存在细胞间隙。叶肉解剖相关指标中(表2)，36个板栗品种间只有栅栏组织密度无显著差异，不适于抗旱性分析，而其他7 个指标在各品种之间均存在极显著差异(P<0.01)，适于进一步进行板栗抗旱性分析。各品种叶片的第一层栅栏组织细胞长度在38.40～73.05 μm 之间，最长品种较最短品种长90.23%；第二层栅栏组织细胞长度在21.14～34.68 μm 之间，最长品种较最短品种长64.04%；栅栏组织厚度在60.48～106.27 μm 之间，平均77.87 μm，其中燕龙、燕晶、遵化短刺和燕金较厚，均在90.00 μm 以上，烟泉最薄；海绵组织厚度在40.41～87.65 μm 之间，平均60.09 μm，燕红最薄，燕龙最厚；栅/海在0.98～2.10 之间，燕光最小，燕红最大；叶片结构紧密度在34.18%～51.64%之间，紫珀最小，燕丽最大；叶片结构疏松度在24.49%～40.74%之间，燕红最小，津早丰最大。

表2 36 个品种板栗叶肉解剖结构特征Table 2 Mesophyll characters of 36 Chestnut cultivars

2.2.4 叶柄和叶脉间距特征比较 叶柄的长度、宽度、长/宽和叶脉间距与植物抗旱性有着不可分割的关系。由表3可知，叶柄长、叶柄宽、叶柄长/宽和叶脉间距在36 个板栗品种间变异系数较大且均有极显著差异(P<0.01)。各品种的叶柄长为16.37～31.70 mm，其中最大值是最小值的1.9 倍；叶柄宽为4.11～7.31 mm，最大值是最小值的1.8 倍；叶柄长/宽为3.06～7.45，最大值是最小值的2.4 倍；叶脉间距为7.62～14.11，最大值是最小值的1.9 倍。

表3 36 个板栗品种叶柄和叶脉间距特征Table 3 Petiole and spacing length of veins characters of 36 Chestnut cultivars

2.3 不同板栗品种抗旱性综合评价

2.3.1 叶片结构特征指标筛选 用主成分分析法将各品种间存在极显著差异的18 项叶片结构指标进一步进行筛选，依据累计贡献率≥85%的原则抽取主成分。结果显示(表4)，前6 个主成分的累计贡献率达到85.844%，较好地概括了18 项指标的大部分信息，因此提取前6 个主成分。各指标对应于6 个主成分因子载荷有极大差异，绝对载荷值越高的指标对主成分的贡献越大，典型性越强，同时依据6 个主成分的权重求得综合得分值F 的表达式系数[23]，即F＝0.210 LT＋0.168 TU＋0.128 TL＋0.034 SL＋0.028 SW＋0.020 SD＋0.037 SPA＋0.168 FPL＋0.144 SPL＋0.173 TP ＋0.141 TS＋0.016 P/S ＋0.052 TLS ＋0.047 LLS ＋0.026 PL ＋0.034 PW－0.012 L/W＋0.056 VSL，该表达式中，指标前系数为正数，说明该指标与F 呈正相关，即与抗旱性呈正相关，反之则呈负相关；指标前系数绝对值即为权重，权重越大，越能反映植物抗旱性。由表4可知，第1 主成分中绝对载荷值较大且彼此间相关性较强的指标是第一层栅栏组织细胞长度(FPL，0.897 )、第二层栅栏组织细胞长度(SPL，0.734 )和栅栏组织厚度(TP，0.911 )，其中TP 在F 值表达式中的系数绝对值最大(＋0.173 )且为正数，因此被选为第一主成分典型指标，其与抗旱性呈正相关。相同方法筛选出叶片厚度(LT，0.892 )为第2 主成分的典型指标、单位面积气孔总周长(SPA，0.705 )为第3 主成分的典型指标、叶柄长(PL，0.548 )为第4 主成分典型指标、叶脉间距(VSL，0.547 )为第5 主成分的典型指标、上表皮细胞厚度(TU，0.630 )为第6 主成分的典型指标，各典型指标均与抗旱性呈正相关。

表4 主成分载荷矩阵表Table 4 Principal components matrix

2.3.2 抗旱性综合评价 由主成分分析可知，筛选的6 项典型指标(叶片厚度、栅栏组织厚度、单位面积气孔总周长、叶柄长、叶脉间距和上表皮细胞厚度)均与抗旱性呈正相关。进一步运用隶属函数法结合各指标的权重计算每个品种6 项典型指标的抗旱性度量值(D)，D值越大，抗旱性越强。按照D值大小标准将36 个品种抗旱性划分为5 个等级类型(表5):高抗旱类型(HR)有燕龙、燕晶、燕金和燕宽；抗旱类型(R)有燕奎、津早丰、燕明、燕紫、东陵明珠、遵化短刺、大板红、遵达栗、燕山短枝和冀栗1 号；中抗旱类型(MR)有遵玉、燕山早丰、燕兴、紫珀、邢丰1、燕丰、燕秋、怀九、迁西早红、燕光、燕平、怀丰和杂35；低抗旱类型(LR)有燕红、大青裂、京暑红、燕丽、燕昌和良乡1 号；不抗旱类型(S)有烟泉、烟青和燕宝。

表5 36 个板栗品种6 项典型指标的隶属函数值和抗旱性度量值(D)Table 5 Membership function values and drought resistance measurements of 6 typical indexes of 36 chestnut varieties (D)

进一步相关性分析表明，36 个品种6 项典型指标的抗旱性度量值(D)与其叶片保水力之间呈极显著正相关(r＝0.957**)，说明采用隶属函数法结合6 项典型指标权重计算的抗旱性度量值对各品种的抗旱性等级划分结果和采用叶片保水力评价板栗抗旱性结果较为一致。

3 讨论

植物叶片解剖结构是叶片保水以满足自身生理代谢的重要物质基础[6]。不同植物叶片解剖结构特征与抗旱性的关系不尽相同[2，15]。橄榄叶片栅栏组织和海绵组织厚度越厚、气孔和表皮毛密度越大，其抗旱性越强[25]；鹊肾树叶片角质层、栅栏组织和叶片越厚，其抗旱性越强[26]；甘蔗叶片厚度、表皮和叶肉厚度越厚、气孔和叶脉密度越大，其抗旱性越强[27]；苹果属植物叶片上下表皮细胞厚度、栅栏组织厚度、栅海比和叶片结构紧密度与其抗旱性呈正相关，而海绵组织厚度和叶片疏松度与抗旱性呈负相关[11]。本研究发现，板栗叶片厚度、栅栏组织厚度、上表皮细胞厚度、单位面积气孔总周长和气孔密度与抗旱性均呈正相关，与观赏灌木[9]、扁桃[10]、苹果[11]、鹊肾树[26]、榛[28]等植物上取得的研究结果基本一致；板栗叶柄长度与抗旱性呈正相关，这与王沛雅等[29]在杨树上的研究结果一致，可能是因为叶柄较长的叶片容易发生扭转运动可避免较强阳光直射，从而减少了水分蒸发；海绵组织厚度和叶片结构疏松度与板栗抗旱性呈正相关的结果与在苹果属植物上的研究结果不同[11]，但与Ennajeha 等[25]

在橄榄上的研究结果基本一致，其认为叶片栅栏组织和海绵组织均较厚的橄榄抗旱性较强，是因为较厚的栅栏组织可能含有较多的CO2固定位点，而较厚的海绵薄壁组织可能促使CO2更容易扩散到这些位点，从而更有利于提高光合作用来增强抗旱性，板栗叶片结构越疏松、海绵组织越厚其抗旱性越好，推测其可能与此类似。另外，Qin 等[27]发现高抗旱甘蔗品种的叶脉密度明显高于低抗旱品种，而本研究发现叶脉间距与板栗抗旱性呈正相关，即抗旱性较强品种叶脉间距较大(叶脉密度较小)，这可能是因为较大的叶脉间距能使叶片具有相对较大的叶肉面积用来进行光合作用从而增强了抗旱性，同时也说明由叶脉主要负责的水分和养分运输系统可能不是板栗提高抗旱性的“短板”，叶柄宽度对板栗抗旱性的影响较小也进一步佐证了这一观点。从本研究结果来看，对板栗抗旱性影响较大的叶片解剖结构指标均具有独特的水分和碳同化优势，比如叶片厚度、栅栏组织和上表皮细胞厚度反映了叶片的储水性，栅栏组织富含叶绿体主要提升叶片的光合能力，单位面积气孔总周长和气孔密度通过影响叶片内外气体交换和水分散失调控叶片的光合作用和蒸腾作用，推测板栗的抗旱性和其光合能力具有密切协同性，光合能力较强的板栗可能具有较高的渗透调节物质、抗氧化物质及激素等与植物抗旱性生理生化相关物质的背景水平。

植物的抗旱性用单一指标难以全面准确地反映各品种抗旱性强弱[30]，然而选入较多指标会因指标间存在的多重共线性而使信息有一定重叠或是产生认识上的偏差[31]，因此需用科学的方法从一系列指标中筛选出彼此相对独立的典型指标来进行抗旱性分析。本研究通过方差分析、主成分分析从21 项叶片解剖结构指标中筛选出与板栗抗旱性密切相关的叶片厚度、栅栏组织厚度、单位面积气孔总周长、叶柄长、上表皮细胞厚度和叶脉间距6 项指标，可作为典型指标来分析板栗的抗旱性。同时，由于各典型指标对抗旱性的贡献(权重)不一样，因此运用隶属函数法结合各典型指标的权重计算出的抗旱性度量值是较为准确可行的抗旱性评价方法[23，32－33]。本研究按照抗旱性度量值大小将36 个品种抗旱性划分为5 个等级类型，而且36 个板栗品种运用隶属函数法结合6 项典型指标权重计算的抗旱性度量值与叶片保水力值呈极显著正相关(r＝0.957**)，说明两种方法的评价结果较为一致。前期，郭素娟等[23]通过研究板栗叶片解剖结构认为燕龙、大板红和燕奎品种抗旱性强，燕山早丰和紫珀抗旱性中等，这与本研究中对该5 个品种的抗旱性划分基本一致。郑龙等[20]测定了板栗离体叶片在干旱胁迫处理下电导率的变化，研究结果表明品种燕红的抗旱性较差，这与本研究中对其的抗旱性评价结果也一致，进一步说明采用隶属函数法结合6 项典型指标的权重计算出的抗旱性度量值和叶片保水力均能够较为准确地评价和区分板栗抗旱性，但由于叶片保水力法具有测定方法简单、样本容量大的优点，因此建议在进行板栗大批量样本抗旱性的初级筛选评价时选用该方法，以提高工作效率。

4 结论

叶片厚度、栅栏组织厚度、单位面积气孔总周长、叶柄长、上表皮细胞厚度和叶脉间距可作为板栗抗旱性评价的6 项典型指标。本研究利用隶属函数法结合6 项典型抗旱指标及权重计算出的抗旱性度量值对36个板栗品种抗旱性类别进行了初步划分，这对京津冀燕山产区板栗品种规划、抗旱育种亲本选择及抗旱机理研究具有一定参考价值。需要注意的是，植物的抗旱性是受多基因调控的数量性状，具体可反映在植物的形态及解剖构造、水分生理生态、生理生化反应、内源激素水平等特征上，而本研究对板栗品种抗旱性强弱的划分仅建立在叶片解剖结构指标和叶片保水力上，未来应结合旱害指数，以及与抗旱相关的生理生化等指标测定加以综合考虑，以获得更客观准确的板栗品种(系)抗旱性结果。