清肺消痤合剂的质量标准研究

唐静月，胡敏敏，卞振华，袁晓航

清肺消痤合剂是医院院内制剂，全方由枇杷叶、桑白皮、黄芩、黄柏、连翘等十味中药组成，具有清热泻火、消肿散结、凉血解毒的功效，临床用于治疗痤疮、粉刺、炎性丘疹，疗效显著。据研究表明，黄芩苷具有抗炎、抗氧化等作用；黄柏具有显著的抗菌、抗过敏等作用，为皮肤科常用药材。为了更好地控制清肺消痤合剂的质量并确保其临床有效性，本研究自2019 年3―11 月采用薄层色谱法对连翘、黄芩、黄柏进行定性鉴别，采用高效液相色谱法对黄芩苷和小檗碱进行含量测定。

1 材料与方法

1.1 仪器

Agilent 1200 高效液相色谱仪（DAD 二极管阵列检测器）；Sartorius BSA224S-CW 分析天平；KQ-100 超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；UV-8紫外分析仪（上海分析仪器厂无锡分厂）。

1.2 材料

连翘、黄芩、黄柏对照药材（批号120908-201216、120955-201810、121510-201606）及连翘苷、黄芩苷、盐酸小檗碱对照品（批号110821-201816、110715-201821、110713-201814）均购自中国食品药品检定研究院；清肺消痤合剂（批号190701、190702、190703，自制）；乙腈为色谱纯，娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

1.3 薄层鉴别

1.3.1

连翘取清肺消痤合剂10 mL，加入乙酸乙酯20 mL，振摇2次，合并乙酸乙酯液并蒸干，加甲醇溶解残渣，定容至2 mL，即得供试品溶液。称取连翘对照药材1 g，加石油醚（30～60 ℃）20 mL，密塞，超声15 min，滤过后弃去石油醚液，残渣挥干溶剂，加甲醇20 mL，超声20 min，滤过后浓缩至5 mL即得对照药材溶液。称取连翘苷适量，加甲醇配得1 mg/mL 对照品溶液。按处方比例称取缺连翘的其余9 味中药饮片，照合剂制备工艺制得缺连翘的阴性样品，按供试品溶液制备方法制得阴性样品溶液。吸取上述四种溶液各3 μL，依次点于同一硅胶G 薄层板，展开系统选择三氯甲烷-甲醇（5∶1），10%硫酸乙醇溶液喷淋后置烘箱105 ℃加热5 min。

1.3.2

黄芩取清肺消痤合剂10 mL，加稀盐酸溶液调节pH值至2，加乙酸乙酯20 mL，振摇2次，合并乙酸乙酯液并蒸干，加甲醇溶解残渣，定容至2 mL，即得供试品溶液。称取黄芩对照药材1 g，加乙酸乙酯-甲醇（3∶1）溶液30 mL，回流提取30 min，滤过后蒸干，加甲醇溶解残渣，定容至5 mL，即得对照药材溶液。称取黄芩苷适量，加甲醇配得1 mg/mL对照品溶液。按处方比例称取缺黄芩的其余9味中药饮片，照合剂制备工艺制得缺黄芩的阴性样品，按供试品溶液制备方法制得阴性样品溶液。吸取供试液及阴性样品溶液各1 μL，对照药材及对照品溶液各3 μL，依次点于同一硅胶G 薄层板，展开系统选择甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（9∶3∶2∶2），2%三氯化铁乙醇溶液喷淋后于日光下检视。

1.3.3

黄柏取清肺消痤合剂40 mL，蒸干，加甲醇溶解残渣，定容至2 mL，即得供试品溶液。称取黄柏对照药材0.1 g，加1%醋酸甲醇溶液40 mL，超声20 min，滤过后蒸干，加甲醇溶解残渣，定容至2 mL，即得对照药材溶液。称取盐酸小檗碱适量，加甲醇配得1 mg/mL 对照品溶液。按处方比例称取缺黄柏的其余9 味中药饮片，照合剂制备工艺制得缺黄柏的阴性样品，按供试品溶液制备方法制得阴性样品溶液。吸取上述四种溶液各3 μL，依次点于同一硅胶G 薄层板，展开系统选择乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（10∶7∶1∶1），于波长 365 nm 的紫外光灯下观察。

1.4 含量测定

1.4.1

色谱条件 色谱柱：Eclipse XDB-C（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸二氢钾溶液（B）梯度洗脱（0～5 min，8%～9% A；5～15 min，9% A；15～17 min，9%～16% A；17～30 min，16%A；30～32 min，16%～25% A；32～45 min，25% A）。检测波长为325 nm，柱温30 ℃，流速为1.0 mL/min，进样量为10 μL。

1.4.2

溶液的制备

1.4.2.1

对照品溶液的制备 精密称定适量对照品，加甲醇分别配得含黄芩苷1.66 mg/mL、含盐酸小檗碱0.47 mg/mL 的对照品储备液。各精密量取5 mL至25 mL量瓶，加甲醇定容，即得。

1.4.2.2

供试品溶液的制备 精密量取本品1 mL至5 mL 量瓶，加甲醇超声（100 W，40 kHz）10 min，定容，即得。

1.4.2.3

阴性样品溶液的制备 分别按处方比例称取其余9味中药饮片，按合剂制备方法制得缺黄芩、缺黄柏的阴性样品，按“1.4.2.2”项配制，即得。

1.4.3

方法学考察 分别将上述3 种溶液按“1.4.1”项条件注入色谱仪，测定，对专属性、线性、精密度、稳定性、重复性和加样回收率进行考察。

1.4.4

样品测定 取清肺消痤合剂3批样品配制供试液，照“1.4.1”项条件进样并计算含量。

2 结果

2.1 薄层鉴别

连翘、黄芩和黄柏薄层色谱图中供试品在与对照药材、对照品对应位置处，呈现颜色一致的斑点，在阴性样品图谱中未出现，对鉴别无干扰，结果见图1～3。

2.2 含量测定

2.2.1

专属性考察 分别将对照品溶液、供试品溶液和缺黄芩、缺黄柏阴性溶液按“1.4.1”项条件注入色谱仪，测定。供试品图谱中2种成分峰形良好，与相邻色谱峰分离完全，阴性无干扰，结果见图4。

图4 HPLC色谱图：A为混合对照品；B为供试品；C为缺黄芩阴性样品；D为缺黄柏阴性样品

2.2.2

线性关系考察 分别精密移取1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，5.0 mL 对照品溶液至 5 mL 量瓶，加甲醇定容。按“1.4.1”项条件测定，记录峰面积。横坐标、纵坐标分别为对照品浓度和峰面积，绘制标准曲线，结果见表1。

表1 线性关系试验结果

2.2.3

精密度试验 按“1.4.1”项下条件连续注入对照品溶液6次，记录黄芩苷、小檗碱峰面积。结果

RSD

分别为0.08%、0.12%。

2.2.4

稳定性试验 取本品（批号190701）配制供试液，在0，2，4，6，8，10，12 h时进样，记录黄芩苷、小檗碱峰面积。结果

RSD

分别为1.24%、0.46%。

2.2.5

重复性试验 取本品（批号190701）6 份，配制供试液，按“1.4.1”项下条件测定，计算各成分含量的

RSD

值。结果

RSD

分别为2.43%、1.74%。

2.2.6

回收率试验 精密移取已知含量的样品0.5 mL 至5 mL 量瓶，平行6 份，分别加入适量黄芩苷和盐酸小檗碱对照品，配制供试液，按“1.4.1”项下条件测定，计算各成分回收率及RSD，结果见表2。

表2 加样回收率实验结果（n=6）

2.2.7

样品测定 3 批样品中黄芩苷和小檗碱的含量结果见表3。

表3 清肺消痤合剂含量测定结果/（mg/L，）

3 讨论

本研究通过TLC 考察了方中主要药味，结果显示连翘、黄芩、黄柏的薄层鉴别斑点清晰，专属性强。试验对连翘进行鉴别时，曾选择多种展开系统，分离效果不佳，选择三氯甲烷-甲醇（5∶1）条件后，发现各项指标良好。试验中黄芩的鉴别方法是在药典方法基础上进行了改进，调整展开系统溶剂比例，显色后日光下观察，操作简便。本研究前期研究发现，方中枇杷叶采用正己烷-乙酸乙酯（7∶3）、三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）、三氯甲烷-丙酮（12∶1）等多种展开系统，均不能有效分离斑点，斑点间界限模糊，比移值不一致。桑白皮药材进过多次展开系统的调整，阴性样品色谱图仍旧显现斑点，存在相似成分，综合考虑后不选择两者进行薄层鉴别。

此外，当流动相为乙腈-0.1%磷酸水时，色谱峰存在拖尾现象，改用乙腈-0.1 %磷酸二氢钾溶液后，黄芩苷、小檗碱和相邻色谱峰分离完全，峰型良好，故选其作为含量测定流动相。方中君药为枇杷叶与桑白皮，枇杷叶中齐墩果酸、熊果酸紫外吸收波长为210 nm，处于末端吸收状态，干扰较大。本试验拟建立同时测定桑皮苷A、黄芩苷和小檗碱的HPLC 含量测定方法，但实验结果发现桑白皮中桑皮苷A 阴性存在干扰，故不选择枇杷叶与桑白皮为含量测定对象。

本研究建立了TLC 法鉴别清肺消痤合剂中连翘、黄芩及黄柏，建立了HPLC 法测定黄芩苷及小檗碱含量，可简便准确的反映该制剂质量，为其质量控制提供了理论依据，可作为有效控制该制剂质量的方法。