头针联合中药对缺血性脑卒中后认知障碍大鼠P38MAPK作用研究

张 野，丛德毓，张红石，胡冠宇，汲广成，王宇峰*

（1.长春中医药大学，长春 130117；2.吉林省中医院，长春 130021；3.长春中医药大学附属第三临床医院，长春 130117）

缺血性脑卒中是引起认知障碍的主要因素，绝大多数缺血性脑卒中患者都会伴有认知障碍，严重者会有抑郁倾向。目前认为认知障碍病变的关键部位在尾状核、丘脑、内囊膝部、角回和额顶叶等，且在左半球损伤的认知障碍较右侧重。流行病学和临床病理研究发现，认知障碍与脑血管病变密切相关。大鼠P38丝裂源活化蛋白激酶（P38MAPK）磷酸化后可被激活，参与炎症、应激反应、细胞凋亡等，是机体众多细胞转导通路的中转站，是各类炎症反应的重要激酶，一般认为激活升高，促进肿瘤细胞凋亡，但是对脑损伤需要进一步研究。研究[1]表明P38MAPK 在阿尔茨海默病血液与疾病持续时间呈正相关，也就是认知障碍患者中P28MAPK 表达增加，且在大脑与学习和记忆相关区域中高度表达[2]。在各种认知障碍动物模型中也进证实了p38MAPK 参与 Aβ 诱导的神经元损伤的证据表明，p38MAPK 活性在认知障碍的病理展中起重要作用，抑制认知神经元细胞中 p38MAPK 的激活是认知障碍的治疗途径之一。

1 材料与方法

1.1 材料 从长春市亿斯实验动物技术有限公司购买SD 大鼠30 只，体质量（220～230）g，进入长春中医药大学实验动物中心饲养，随机分为3 组，每组10只，其中2 组进行脑卒中造模，随机选择1 组作为头针联合中药组进行头针和中药治疗，另1 组作为模型组不予治疗，未造模1 组作为空白组作为健康对照，饲养间保持温度光照和湿度为23℃、12/12 光照周期（55±10）%，并自由饮水。实验过程符合实验动物伦理要求，已经通过长春中医药大学伦理委员会审批（20190151）。

1.2 缺血性脑卒中大鼠模型建立 采用改良的大脑中动脉栓塞在灌注（MCAO）造模法，术前24 h大鼠禁食不禁水，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.35 g/kg），确保大鼠手术全程无痛，以仰卧固定后常规消毒。在颈部正中切一口，用止血钳钝性分离组织，找到左侧颈总动脉，分离左侧颈内动脉和颈外动脉，挂线备用，结扎颈外动脉。再结扎颈总动脉，夹闭颈内动脉。在颈总动脉上距离分叉2 mm 处剪一斜口，穿入线栓，轻提颈内动脉缝合线并松开颈内动脉血管夹，沿颈内动脉将线栓穿过颅骨直至手下有明显阻力时（18 mm），实现大脑中动脉阻塞，导致脑缺血。结扎切口并固定线栓，剪断多余部分缝合线，缝合伤口，予大鼠注射青霉素20 万单位，防止感染，完成造模。造模后进行神经功能评分。

1.3 干预方法 头针联合中药治疗，在造模成功后，首先中药灌胃，按照成人1/30 的比例用量，以赤芍20 g，川芎20 g，蒲黄20 g，葛根20 g，槐花20 g，地龙20 g，红花12 g，豨莶草30 g，三七18 g，加适量水熬2 h，剩余药液300 mL。给药时每只大鼠灌胃5 mL。头针治疗在灌胃后进行，取脑部的顶区及顶前区，以0.5 寸针向前方刺入，采取丛刺法和长留针方式，以医用胶布块固定，放入无垫料笼中，配合带针运动，留针6～8 h，每日1 次，每周针刺5 次，持续4 周。

1.4 血清和脑组织中p38MAPK 浓度测定 治疗周期结束后，分别将空白组、模型组、联合组的大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.35 g/kg），确保大鼠肌肉放松并且无痛，剪开腹腔，腹主动脉取血5 mL，并将血液样本离心（2 000×g，4℃、15 min），离心后获得上层血清。大鼠处于麻醉状态，取血后断头处死，立即剥离脑组织，脑样本按质量体积比1 g:9 mL 加入9 倍体积的磷酸盐缓冲液（PH 7.4），手工或匀浆器将标本充分匀浆并离心（2 000×g，4℃、15 min），收集上清液体备用。采用ELISA 法检测大鼠血清p38MAPK（南京建成生物工程研究所；大鼠96T），严格按照试剂盒说明书步骤进行实验。

1.5 大鼠行为学检测 Morris 水迷宫试验，用于测试大鼠的复杂记忆和空间定位能力。水迷宫（ZS-001moriss）由一个圆柱形水槽和图像采集分析系统构成（DIGITAL CCD CAMERA），四周围有遮光布，减少外界干扰，利用动物求生本能，寻找隐藏水中的平台，记录每只大鼠所需要的时间和路线。

1.6 观察指标 观察各组大鼠血清及脑组织中p38MAPK 的浓度和大鼠行为学检测的水迷宫测试、悬吊试验，并且结合大鼠行为学改变与大鼠血清和脑组织内p38MAPK 的浓度变化分析头针联合中药的作用机制。

1.7 统计学方法 采用SPSS 24.0软件进行统计处理，计量资料用均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，治疗前后对比采用独立样本t检验，P＜0.05 为差异具有统计学差异。

2 结果

2.1 建模结果 建模后未出现大鼠腹膜炎迹象，具有正常生命体征，观察10 只空白对照大鼠和20 只造模大鼠（模型组和联合组）在造模前后的行为学变化，水迷宫测试结果显示造模前3 组无统计学差异，造模后2 组与空白组比较具有统计学差异（P＜0.05），提示造模成功，见表1。

表1 各组造模前后水迷宫测试时间比较（，n =10）s

表1 各组造模前后水迷宫测试时间比较（，n =10）s

注：与空白组比较，# P ＜0.05

2.2 P38MAPK 浓度结果 大鼠血清中P38MAPK 浓度结果显示，空白组与模型组比较，具有显著的统计学意义（P＜0.01）；联合组与模型组比较，具有显著性统计学意义（P＜0.01）。大鼠脑组织中P38MAPK浓度结果显示，空白组与模型组比较，具有统计学意义（P＜0.05），联合组与模型组比较，具有统计学差异（P＜0.05），见表2。

表2 各组血清与脑组织内P38MAPK 比较（，n =10）（nmol/L）

表2 各组血清与脑组织内P38MAPK 比较（，n =10）（nmol/L）

注：与模型组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01

2.3 治疗1 周后大鼠行为学功能结果 观察3 组大鼠在治疗前后的行为学变化。水迷宫测试结果显示，联合组在治疗前后比较，寻找平台时间减少，具有显著性差异（P＜0.01），治疗后模型组分别和空白组、联合组比较，均具有统计学差异（P＜0.05），见表3。治疗后模型组、空白组、联合组大鼠行为学路线比较，见图1。

表3 各组治疗前后水迷宫测试时间比较（，n =10） s

表3 各组治疗前后水迷宫测试时间比较（，n =10） s

注：与其他2 组比较，# P ＜0.05

图1 大鼠治疗前后水迷宫测试路线比较

3 讨论

缺血性脑卒后的认知障碍属于中医理论中的“呆病”范畴，是脑动脉梗死引起的脑组织缺血和缺氧而导致。针刺和中药临床联用疗效显著，研究[3]表明针灸和中药可以抗血栓、保护血管，能够对于血管内皮组织细胞产生影响，从而促进血管内皮再生和重塑，增加侧支循环，结合长白山通经调脏手法流派学术实践，采用头针联合中药的治疗方案进行治疗，一方面通过对督脉的疏通，调节脑内神经功能，尤其注重观察神智方面症状的改善；另一方面活血化瘀的药物，调节血管内皮细胞，促进血管再生，达到“治神调形”的效果，临床应用较广，疗效确切，但是多停留于理论方面和临床观察研究，在作用机理方面仍然缺乏足够认识。

头针联合中药治疗方案是基于活血通经的传统治疗原则和脑缺血后的血管再生保护机制而确立。血管再生（angiogenesis）是通过血管内皮细胞的分化增殖、转运、重组、分裂、分支而形成新的血管网络，从而改善局部血液循环和血氧供应，与中医的活血通经理论具有一致性，在既往的临床治疗中显示具有良好疗效，但是缺少理论机制的研究。脑卒中是由于大脑动脉突然闭塞而导致的脑血流减少，脑组织由于循环不足、缺少氧气以及能量不足而导致神经元、胶质细胞、内皮细胞等功能损害，致使认知障碍等一系列病变。所以基于《灵枢经》“头有气街”理论，并结合缺血性脑卒中与头气街的联系，应用头针方法进行治疗。治疗脑卒中主要选取顶区和顶前区以及额区，并以头部的重要经脉督脉作为纵向维度基准，既符合头针分区理论又兼顾通督调神理念。本研究选取活血化瘀的赤芍、红花、地龙、蒲黄、三七和通经络的川芎、葛根、槐花、豨莶草进行组方，依据临床实践中对于卒中后认知障碍治疗，进行对脑卒中后认知障碍大鼠模型治疗的实验，并结合p38MAPK 探索其作用机制。

P38MAPK是能够感受不同的生物学刺激的物质之一，参与许多信号传到通路，在中枢系统中P38MAPK与学习和记忆功能相关[4]，在学习记忆区域高度表达，可能是相关脑功能的关键信号[5]。实验结果表明，造模后模型组的血清内检测P38MAPK 浓度高于空白组（P＜0.01）。造模后模型组的脑组织内P38MAPK浓度高于空白组（P＜0.05），说明脑卒中后认知障碍大鼠模型的血液及脑组织中P38MAPK 浓度均受到影响，这与研究[6]关于P38MAPK 参与Aβ 诱导神经元损伤的研究一致。杨申[7]予血管性痴呆大鼠模型P38MAPK 抑制剂SB202190，结果证明P38MAPK 是导致认知障碍发生的物质之一，且相关通路具有促进神经元生长作用。研究[8]发现P38MAPK 可以激活下游Caspase-3，能够启动细胞的凋亡，造成神经细胞损伤，治疗后联合组血清内P38MAPK 浓度低于模型组（P＜0.01），联合组脑组织内P38MAPK 浓度低于模型组（P＜0.05），说明头针联合中药的方案能够通过干预P38MAPK 修复卒中后大鼠认知障碍功能。P38MAPK 可以激活下游Caspase-3，能够启动细胞的凋亡，造成神经细胞损伤。治疗后联合组血清内P38MAPK浓度低于模型组，有显著性差异（P＜0.01），联合组脑组织内P38MAPK 浓度低于模型组，有统计学差异（P＜0.05），说明头针联合中药的方案能够通过干预P38MAPK 从而修复卒中后大鼠认知障碍功能。

综上所述，本研究表明大鼠脑组织和血清内P38MAPK 浓度升高与大鼠缺血性脑卒中的认知障碍发生相关，大鼠血清和脑组织内P38MAPK 参与卒中大鼠认知恢复过程，头针联合中药的治疗方案可以促进卒中后认知障碍大鼠模型血清及脑组织内P38MAPK的浓度降低，能够促进修复受损伤大鼠模型的空间记忆能力。