黑松露发酵液配方研制及实验优化

2021-07-27田园诗杨士春温潇雄张劲夫刘芮廷

实验室研究与探索 2021年6期

田园诗，杨士春，温潇雄，张劲夫，刘芮廷

（天津农学院水利工程学院，天津300380）

0 引言

黑松露中含有丁酸盐、丙酸盐，对巨噬细胞具有抗炎作用，能通过杀死水体中细菌、病毒的方式来净化水体，黑松露中含有的葡聚糖在微咸水灌溉中能够激活植株的抗氧化酶系统，减缓盐离子胁迫，从而阻止根系损伤。因此探究黑松露发酵的最佳条件对水质净化和微咸水灌溉有着非常重要的意义［1-6］。

由于农业上过量施用含有氮、磷、钾等化肥、农药、粪尿等有机物及人畜肠道病原体，而普通复合肥的吸收利用率在30%左右，剩余的肥料会在土壤中被大量固定，从而使得土壤的化学性状出现变化，导致土壤的供肥能力下降，用量大了也会加剧土壤盐渍化［7-9］。如果忽略了中微量元素的施用，长期以往必会导致土壤养分失衡。若长期不补充有益微生物菌，土壤中有益微生物数量减少，导致土壤板结，根际环境恶劣，根系无法有效吸收土壤中的养分。劣质粪肥的使用也会加重土壤盐分积累。除此之外，长期使用大水漫灌浇水方式会对土壤造成压实和淋洗的不良影响，抑制根系对养分的吸收，加重土壤盐分浓度［10］。排灌设施老化不匹配，沟渠过浅，排水不畅，也会导致地下水位上升，导致盐分积累，盐渍化加剧［11］。

我国从上世纪70年代开始进行微咸水灌溉研究，证明微咸水灌溉相比旱作产量增加3～4倍［12］。试验发现，增加1次微咸水灌溉或微咸水替代淡水灌溉，可以实现小麦稳产或增产的效果，在轮灌与混灌处理下有压碱压盐、作物增产的效果，利用微咸水灌溉与旱作相比产量较高［13］。用地下微咸水对灌溉小麦补充拔节水、灌浆水，产量达到淡水灌溉的90%。目前，国内外黑松露的研究领域涵盖了饮食、医疗、种植保健等方面，大部分研究者更专注于黑松露的种植研究，我国在黑松露上所做的研究已得到较大重视但仍有很多方面有待继续研究补充，在通过黑松露在益生菌作用下发酵水溶液的特性变化的相关研究较少［14］。我国丰富的菌类产物有利于天然活性产物的研究。本文以黑松露发酵液的制备为研究出发点，希望对黑松露发酵液的配制及优化，能为微咸水灌溉溶液的制备提供一个可行的参考。

1 实验方案选用

1.1 分光光度计法

分光光度计法应用广泛，仪器分辨率高，杂散光低，灵敏度高，稳定性、可靠性强，分析准确，操作也比较简便。步骤一般有：仪器预热；旋动波长手轮，把所需波长对准刻度线；将装有溶液的比色皿放置比色架中，令参比溶液置于光路；盖上样品室盖，调节透光率“100%T”旋钮，使数字显示为“100.0T”；吸光度A的测量。仪器调T为0和100%后，将选择开关转换至A调零旋钮，数字显示应为“.000”。然后拉出拉杆，使被测溶液置入光路，数字显示值即为试样的吸光度A；测定完毕后，先打开样品室盖，再断电源，比色杯应清洗干净后，再贮放保存；浓度直读按MODE键，使CONC批示灯亮，交已标定浓度的溶液移入光路，按下溶液调节键（↑100%T键的↓0%键），使数字显示为标定值，将被测溶液移入光路，即读出相应浓度值；仪器数字显示背后，装有接线柱，按下FUNC键，可输出模拟信号。

1.2 对照实验法

对照试验是检定测定方法是否存在系统误差的方法之一。对照试验一般分为以下几步：首先，根据实验目的和变量对实验材料以及用具分组，应注意每组除所探究的实验材料外，其他条件全部相同；其次，对各组进行不同实验变量处理，施加实验变量的组为实验组，不施加实验变量的组为对照组，应注意合理设计对照试验以及正确处理实验变量；最后，在其他条件都相同的条件下，培养一段相同的时间，观察并记录实验结果，分析不同实验变量对实验结果造成的不同影响，应注意控制好无关变量，保证实验遵循单一变量原则。

2 实验条件分析

2.1 黑松露发酵粉中葡聚糖含量测定

2.1.1 黑松露摇瓶发酵液气相色谱分析

（1）锥形瓶清洗、消毒、灭菌。用洗涤剂将三角瓶里外清洗一遍，冲去泡沫，再往瓶里注入蒸馏水放入锅里在电磁炉上煮沸并重复3次，最后把三角瓶里的水倒净，放入烤箱，温度调到108℃，温度恒定后取出备用。

（2）用臼式研磨仪把黑松露片研磨成粉末。

（3）用电子秤称取1 g研磨好的黑松露粉末，共25次，分别用药匙移入25个锥形瓶中，编号依次为1～25。

（4）用移液管取2 mL姬松茸菌种24次，分别加入到编号为1～24的锥形瓶中，再用量筒量取10 mL培养基12次，分别加入到编号为1～12的锥形瓶中，最后用量筒量取30 mL蒸馏水加入到编号为1～25的锥形瓶中。

（5）用棉塞对上述编号1～25的锥形瓶进行封口，防止外界微生物进入，保持三角瓶内部无菌状态。

（6）把编号的三角瓶放到同一摇床中，参数设定为：温度28℃，转速150 r/min，时间24 h。

（7）经过24，48、72、96、120，144 h对摇床中的样品逐一取样，每天取4个样，分别为该时段加入培养基和不加培养基的各2个，编号为25的锥形瓶在144 h下进行取样。具体操作为：用去掉针头的一次性注射器从三角瓶中取出发酵液，放入5 mL容量瓶中，再把容量瓶放入离心机离心沉淀15 min。离心结束后给注射器安上孔径为0.22μm的过滤嘴，使上清液过滤到2.0 mL的容量瓶中，编号与之前对应，盖好盖子。

（8）通过使用分光光度计在510 nm吸光度下对黑松露发酵粉样品进行测量、分析、计算，得：葡聚糖2.52 ng/kg，超氧化物歧化酶活性60.8 U/g，中性蛋白酶活性55 U/g。

2.1.2 黑松露发酵粉中葡聚糖含量的测定结果分析

葡聚糖作为一种多糖，存在于某些微生物中。黑松露发酵粉中含有葡聚糖含量为25.2 ng/g，超氧化物歧化酶活性为60.8 U/g。葡聚糖能激活植物体内抗氧化酶系统，对超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等这些抗氧化酶的活性有激活作用，且激活植物体内的酶抗氧化活性比体外补充相同等量的酶的活性高成百倍上千倍。被激活的超氧化物歧化酶等抗氧化酶的活性，可以使细胞较有效地清除H2O2等强氧化剂。在微咸水灌溉中，葡聚糖通过激活超氧化物歧化酶的活性，减缓微咸水中盐胁迫对植物根部的膜质过氧化作用，使植物通气组织和根部的抗氧化能力得到改善，提高了植物对水分的吸收量，缓解了微咸水灌溉造成的渗透胁迫（渗透胁迫表现为植株根系周围土壤盐分过高，根系渗透吸水困难，植株水势下降，造成生理干旱）。可以利用葡聚糖开发一种新型的植物肥料，既可以解决微咸水灌溉中含盐量高造成的土壤积盐，影响作物对水分的吸收造成的减产的问题，又可以避免大量使用氮肥、钾肥、磷肥来提高抗氧化酶系统后造成的水体富营养化。

2.2 黑松露发酵粉中酸含量测定

2.2.1 黑松露发酵粉中酸含量

由已知实验标样得到各种酸和醇的线性方程如图1所示。据丁酸、异丁酸、丙酸、乙酸、异戊酸、正庚酸、正己酸的线性方程和酸随响应值变化，得到各种酸含量如表2～4所示。

图1 黑松露发醇粉中酸和醇的线性方程

表2 丁酸、异丁酸、戊酸含量计算表

表3 异戊酸、乙醇、乙酸含量计算表

2.2.2 黑松露摇瓶实验

为了能够提高数据的准确性和更直观地看出各个时间段各种发酵产物的变化，取两组平行实验的浓度平均值作为最终浓度，具体浓度如表5所示。

表5 表乙醇、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸异、戊酸、己酸平均浓度 ng/kg

表4 丙酸、己酸、庚酸含量计算表

从表5可以得出，加入培养基和菌种情况下，乙醇浓度最高，总浓度为27 388.282 g/L；各种酸中丁酸的浓度最高，总浓度为352.743 mg/L，戊酸浓度最低（总浓度为除时间外其他条件相同下的总和）。

2.2.3 实验结果分析

从表5中可以看出，在加入培养基的条件下除异丁酸外产生的乙醇、乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸、己酸之和都比未加入培养基条件下要多，且加入培养基条件下产生的各种脂肪酸的总和也大于未加入培养基条件下产生的脂肪酸的总和。分析可以得出：培养基能促进酵母菌生长、繁殖，所以增加了乙醇、乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸、己酸的含量。

由表5中分析可得，黑松露发酵液产生的丁酸、乙醇、乙酸、丙酸、异丁酸、异戊酸、己酸在加入培养基的条件下地最佳发酵时间为72、24、72、48、144、96、48 h，黑松露发酵液产生的丁酸、乙醇、乙酸、丙酸、异丁酸、己酸在未加入培养基的条件下地最佳发酵时间为24、144、144、48、144、24 h；所以不同的发酵条件有不同的最佳发酵时间。

综上所述，在发酵时间为72 h，加入培养基和菌种的条件下能产生更多的脂肪酸，尤其是丁酸和丙酸，该条件下丁酸含量为130.644μg/kg。脂肪酸能够抑制促炎性细胞的产生和分泌，同时刺激生产和生产释放抗炎细胞因子，这些细胞因子在炎症细胞中的基因表达的修饰由丙酸和丁酸的组蛋白乙酰酶抑制活性引起［15］。国外研究显示病毒普遍存在于各种水体中，例如：江、河、湖、海、地下水，乃至经过净化处理过的自来水都含有一定量的病毒和细菌，国内有研究人员检测了渤海中地污染情况，检测发现海水中的肠道病毒浓度范围为6.3～1.7 mg/L，发现轮状病毒在北京水源水中的检出率为34.6%［16］。丁酸盐和丙酸盐能杀死水体中的细菌与病毒，对水体有净化作用，让人们喝到安全健康的水。