磁性纳米探针的构建及其对细菌分离应用

温聪颖， 訾 敏， 张瑞巧， 赵令今

（1.中国石油大学（华东）理学院，山东青岛266580；2.青岛市农业科学研究院，山东青岛266100）

0 引 言

化学是一门以实验为基础的科学，实验教学至关重要［1-2］，传统实验教学体系有助于培养学生的基本实验技能，但不利于提高学生的综合实验能力和科研素养［3-5］，综合研究型实验已经成为传统实验教学的有益且必要的补充［6-8］。近年来，基于磁性纳米材料的分离技术在分离和富集领域展现出极大的应用前景，分离对象可以是离子、小分子、生物大分子、病毒、细菌、细胞等［9-11］。相比于传统的化学分离技术，磁分离方法具有操作简便、成本低廉、条件温和等优点［12-13］。因此，作为相关专业的大学生，非常有必要了解这方面的前沿知识并熟悉相关实验操作。基于此，结合前期的科研工作［14-16］，本文设计了磁性纳米探针的构建及其对细菌分离应用综合研究型实验，该实验通过将磁性纳米颗粒包埋到高分子球内部制得具有优良超顺磁性的磁性纳米球，并通过共价偶联在磁球表面修饰大肠杆菌抗体，利用抗体对抗原的识别作用实现了大肠杆菌的特异高效的捕获和分离。一方面该实验将材料合成、表征、修饰、应用形成一套完整的科研训练过程，极大地培养了学生的实验技能、科研素养和创新精神；另一方面该实验涉及磁性纳米材料、细菌分离等科学研究热点，有助于学生了解科学前沿进展并体会科学研究的魅力，从而激发学生学习的积极性以及从事科学研究的兴趣。目前，该实验已经在我校化学专业学生中示范开展，并取得了较好的教学效果。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

试剂：氯仿、正丁醇、正己烷、乙醇、氯化钠，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠购自中国医药集团上海化学试剂公司；小鼠源抗大肠杆菌抗体、cy3染料标记的兔抗小鼠抗体、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、Hoechst 33342染色剂等购自Sigma-Aldrich公司；细菌培养基购自Oxoid公司；大肠杆菌、芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌由中国石油大学（华东）生物中心提供；油溶性磁性纳米颗粒、表面带羧基的多孔高分子球由本课题组合成［14］。

仪器：恒温摇床，恒温培养箱，生物超净工作台，超声波清洗器，荧光倒置显微镜，磁力架，透射电子显微镜，分析天平，细菌比浊仪等。

1.2 磁性纳米球的制备

取1.8 mL多孔高分子球于离心管中，16 000 r/min离心30 min，去掉上清，晾置5 min得到高分子球沉淀；与此同时，取500μL油溶性磁性纳米颗粒，加入1.5 mL乙醇，12 000 r/min离心5 min，去掉上清，晾置5 min得到磁性纳米颗粒沉淀；用600μL溶胀剂（570 μL正丁醇＋30μL氯仿配制而成）超声分散磁性纳米颗粒，然后加入到高分子球沉淀中，继续用超声波清洗器超声30 min；用正己烷离心洗涤1次，乙醇离心洗涤2次；将所得沉淀分散到1 mL超纯水中，超声1 h，静置过夜取上清即得磁性纳米球。

1.3 磁性纳米球的生物功能化

取250μL磁性纳米球，用磷酸盐缓冲溶液（0.01 mol/L，pH 6.8）通过磁分选洗涤2次，分散到500μL磷酸盐缓冲溶液（0.01 mol/L，pH 6.8）中，超声分散均匀；同时用500μL磷酸盐缓冲溶液（0.01 mol/L，pH 6.8）溶解10 mg EDC和5 mg NHS后迅速加入到磁性纳米球中；混匀后置于摇床上150 r/min室温反应30 min；将上述磁性纳米球用磷酸盐缓冲溶液（0.01 mol/L，pH 7.2）洗涤2次，分散到1 mL磷酸盐缓冲溶液（0.01 mol/L，pH 7.2）中，加入50μg大肠杆菌抗体，置于摇床上150 r/min室温反应4 h；将产物用磷酸盐缓冲溶液（0.01 mol/L，pH 7.2）洗涤5次，即得抗大肠杆菌免疫磁球，将其分散到250μL生理盐水中，存于4°C冰箱待用。

1.4 细菌的培养、计数与染色

将大肠杆菌、芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌以划线法分别接种到麦康凯（MacConKey）琼脂培养基上，于37°C恒温培养箱中培养24 h，挑取单个菌落分散到生理盐水中制得细菌悬液，通过麦氏比浊法控制细菌悬液浓度约为108CFU/mL（0.5麦氏单位）。细菌悬液准确浓度的测量通过定量接种进行，具体操作为：将细菌悬液稀释105倍，取100μL稀释液定量接种到MH琼脂培养基上，于37°C恒温培养箱中培养24 h，对长出的菌落进行计数，再乘以稀释倍数即换算为细菌原液的浓度。需要注意的是，细菌培养要保证无菌操作，以避免其他杂菌的污染。利用Hoechst 33342对细菌的DNA进行染色，具体操作为：在细菌悬液中加入Hoechst 33342，使Hoechst 33342的终浓度为30 μg/mL，置于37°C恒温摇床上，避光反应30 min。

1.5 磁性纳米球对细菌的捕获和分离

将抗大肠杆菌免疫磁球加入到大肠杆菌悬液中，置于恒温摇床上37°C下孵育30 min，利用磁力架进行磁分选，并用生理盐水洗涤3遍，收集捕获产物进行相关实验。①将捕获产物分散到超纯水中，取10μL滴到碳支持膜上，放置过夜晾干，用透射电镜进行观察；②将捕获产物用Hoechst 33342进行染色，置于荧光显微镜下通过紫外光激发进行观察；③对加入的细菌的数量（N0）和捕获后清液中剩余的细菌的数量Ns进行平板计数，通过下式计算捕获率：

为了考察捕获的特异性，同时将抗大肠杆菌免疫磁球加入到芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的悬液中，在摇床上孵育30 min后进行磁分选，收集捕获产物染色后通过显微镜进行观察，并计算捕获效率。

2 结果与讨论

2.1 磁性纳米球的表征

本文所使用的高分子聚合物纳米球表面亲水，富含羧基，内部为疏水结构，在溶胀剂的作用下可以产生疏水空腔，通过超声作用，油溶性的磁性纳米粒子进入疏水空腔中，将纳米球转移到水相后，纳米球迅速缩小，从而将磁性纳米粒子禁锢在高分子球内部，制得磁性纳米球。从磁性纳米球的透射电镜图（图1（a））可以看出，纳米球的尺寸在250 nm左右，表面较为光滑平整，内部含有衬度更大的小颗粒，从而直观地证明了磁性纳米粒子进入了高分子球内部。进一步对磁性纳米球的磁性能进行表征：磁性纳米球的磁滞回线（图1（b））表明磁性纳米球具有优良的超顺磁性，其矫顽力几乎为零，饱和磁化强度达到19.3 A·m2/kg；且其磁响应迅速，将磁性纳米球悬液用磁铁吸引2 min，几乎所有的磁性纳米球均被吸引到靠近磁铁的管壁上（图1（c）），因此可以通过磁铁方便地操纵磁性纳米球。

图1 （a）磁性纳米球的透射电镜图；（b）磁性纳米球的磁滞回线图；（c）磁性纳米球在磁力架（磁铁）吸引不同时间下的照片

由于磁性纳米粒子包埋到高分子球内部，因此高分子球表面的羧基几乎不受影响，通过活化可以实现与抗体表面氨基的共价偶联。利用免疫荧光的方法验证了抗体是否成功偶联到磁性纳米球上：通过将未修饰的磁球和偶联了小鼠源抗大肠杆菌抗体的免疫磁球分别与cy3染料标记的兔抗小鼠抗体孵育，磁分离并洗涤后，利用荧光显微镜观察磁球表面是否存在cy3的红色荧光。实验结果如图2所示，未修饰的磁球没有荧光，而免疫磁球表面呈现出cy3的红色荧光。这表明cy3标记的兔抗小鼠抗体（二抗）没有和未修饰磁球发生反应，而与偶联了小鼠源抗大肠杆菌抗体（一抗）的免疫磁球发生了免疫亲和反应，从而证明了小鼠源抗大肠杆菌抗体被成功地修饰到磁球表面。

图2 （A-B）未修饰的磁性纳米球和cy3标记的兔抗小鼠抗体作用后的显微镜明场图片和对应的荧光场图片；（C-D）偶联了抗体的免疫磁球和cy3标记的兔抗小鼠抗体作用后的显微镜明场图片和对应的荧光场图片

2.2 磁性纳米球对细菌捕获和分离效果

将免疫磁球分别加入到大肠杆菌悬液、芽孢杆菌悬液和金黄色葡萄球菌悬液中，反应后将捕获产物用DNA染料Hoechst 33342进行染色，置于荧光显微镜下观察，如图3（A～F）所示，只有大肠杆菌组出现蓝色荧光点，即为Hoechst 33342与大肠杆菌的DNA作用后在紫外光照射下发出的荧光，且与明场中磁球的团聚有良好的对应关系，而芽孢杆菌组和金黄色葡萄球菌组都没有出现蓝色荧光且磁性纳米球分散良好，从而证明免疫磁球成功地捕获到大肠杆菌，而没有捕获芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌。进一步对免疫磁球对细菌的捕获率进行了定量计算（见图4），免疫磁球对大肠杆菌的捕获率达到了96%以上，而对芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的捕获率不足3%。以上实验表明免疫磁球具有良好的选择性，可以通过抗原与抗体的结合特异性地识别和捕获大肠杆菌。同时，采用透射电镜对捕获的大肠杆菌进行表征，结果如图5（A-B）所示，图片中的球状物体即为免疫磁球，杆状物体即为被捕获到的大肠杆菌，大肠杆菌表面分布有免疫磁球，透射电镜图更为直观地展示了免疫磁球和大肠杆菌的成功结合，说明免疫磁球能够很好地识别目标细菌。

图3 （A-B）免疫磁球捕获大肠杆菌后的显微镜明场图片和对应的荧光场图片；（C-D）免疫磁球捕获芽孢杆菌后的显微镜明场图片和对应的荧光场图片；（E-F）免疫磁球捕获金黄色葡萄球菌后的显微镜明场图片和对应的荧光场图片

图5 免疫磁球捕获大肠杆菌的透射电镜图

3 结 语

本实验合成了具有优良超顺磁性的纳米球，进一步在其表面偶联大肠杆菌抗体，实现了大肠杆菌的特异高效的捕获和分离。实验内容丰富，从材料制备修饰到表征应用形成一套完整的科研训练过程，涉及到生物偶联、荧光标记、平板计数、免疫反应、捕获分离等常规的化学及生物操作技术，以及透射电镜表征、荧光显微镜表征、磁性表征等常规的表征方法。本实验具有较强的综合性、可操作性、前瞻性和新颖性，非常适合作为化学、生物、材料等相关专业的综合实验。通过在本校化学专业学生中示范开展，学生对实验项目表现出极大的兴趣和专注力，能够积极主动地完成课题，并准确地分析实验数据和结果。经过这一套完整的科研训练，不仅极大地培养了学生的综合实验能力和分析问题解决问题的能力，而且有助于学生了解科学前沿并体会科学研究的魅力，从而激发其科研兴趣并培育其科研素养。