团头鲂scxa基因SNP位点与肌间骨数目的关联性分析

王旭东,唐雨甜，熊雪梅,周佳佳,李相珊,曹树洪,高泽霞,4

1.华中农业大学水产学院/农业农村部淡水生物繁育重点实验室/农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室/湖北省名优鱼育种与健康养殖工程技术研究中心/长江经济带大宗水生生物产业绿色发展教育部工程研究中心，武汉 430070；2.武汉农业检测中心，武汉 430023；3.湖北省阳新县浮屠镇水产服务中心，黄石 435239； 4. 湖北洪山实验室，武汉 430070

团头鲂(Megalobramaamblycephala)作为我国大宗淡水养殖鱼类之一，肌间骨的存在严重影响了其食用和深加工价值。肌间骨(intermuscular bones,IBs)仅存在于低等真骨鱼类中，由肌膈间的肌腱骨化而来。对肌间骨的相关研究中，形态学研究较多[1]。近年来，鱼类肌间骨分子机制研究取得了较大进展。Yang等[2]、Su等[3]、Zhang等[4]对BMP家族基因进行研究，结果表明部分BMP家族基因与肌间骨发生发育密切相关；Nie等[5-6]、Wan等[7-8]分别对肌间骨相关的组学数据进行分析，揭示了肌间骨发育中重要的候选基因和microRNA。在分子育种研究中，Tang等[9]研究表明镜鲤肌间骨数量性状遗传力属于中等遗传力，并发现8个肌间骨QTLs和29个肌间骨相关的候选基因。Xiong等[10]评估显示，团头鲂脉弓小骨数量性状遗传力为0.37，属于中等遗传力。Wan等[11]首次利用混合分组分析法筛选出181个与肌间骨数量相关的候选SNP位点。Perazza等[12]发现无肌间骨大盖巨脂鲤(Colossomamacropomum)群体，Nunes等[13]通过GWAS分析获得了与大盖巨脂鲤肌间骨数量显著相关的675个SNP位点，并且有13个位点位于骨相关的候选基因附近。目前，基因多态性已被证实与鱼类生长[14]、抗病[15-16]、繁殖[17]、耐低氧[18]等多种性状有关联，因此，针对鱼类肌间骨性状的分子育种具有可行性。

Scleraxis (scx)是肌腱早期发育中的一个特异性的标志转录因子，对肌腱组织的分化起到重要作用[19]。Kague等[20]通过敲除斑马鱼scxa和scxb基因，发现scx基因在斑马鱼肌腱发育和骨骼矿化过程中发挥作用。Nie等[21]的研究表明scxa基因对鱼类肌间骨的数目具有一定的调控作用。因此，研究scxa基因的多态性与团头鲂肌间骨数量性状之间的关联性，筛选与团头鲂肌间骨数量显著相关的分子标记具有重要意义，可为少刺团头鲂品种选育提供分子基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用团头鲂均来自湖北百容水产良种有限公司。参考万世明等[22]的肌间骨数目统计方法，对640尾团头鲂进行肌间骨数目计数(在进行肌间骨数目统计前，采集样本的体长等生物学信息，并用无水乙醇保存尾鳍鳍条，最终选取24尾肌间骨数目不大于102的个体，21尾肌间骨数目不小于129的个体构建肌间骨数目极端群体。采用醋酸铵/异丙醇法提取DNA。

1.2 团头鲂scxa基因克隆

从Ensembl(http://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index)上查找斑马鱼scxa基因序列，与团头鲂二代全基因组测序数据进行比对，获得匹配的DNA序列及其相应的染色体坐标，与团头鲂二代测序转录组序列进行比对，获得团头鲂scxa基因序列结构及相应染色体坐标，使用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测开放阅读框，利用NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)验证和翻译序列。使用Primer Premier 5.0对团头鲂scxa基因序列设计引物(见表1)，送至武汉擎科生物科技有限公司进行合成。以肌间骨数量极端个体的基因组DNA为模板进行PCR扩增，检测产物质量后，送至武汉擎科生物科技有限公司测序。使用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析编码蛋白的理化性质；ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白亲疏水性；TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)预测蛋白跨膜区结构；使用DNAMAN对不同脊椎动物scx基因进行同源性分析，采用最大似然法(maximum likelihood，ML)构建系统发育树。

1.3 团头鲂scxa基因组织表达分析

Trizol法提取1龄团头鲂8个组织的总RNA，并逆转录成cDNA。利用Primer Premier 5.0设计其定量引物(表1)，以β-actin为内参基因。使用ABI QuantStudio 6 Flex荧光定量PCR仪(Thermo Scientific，美国)检测scxa基因在团头鲂8个组织的表达情况，按照HieffTM qPCR SYBR© Green Master Mix (Low Rox Plus)(翊圣，上海)说明书进行实验，每个样品设置3个平行，PCR程序为：95 ℃，5 min；95 ℃，10 s；62 ℃，20 s；72 ℃，20 s; 95 ℃，15 s； 62 ℃，1 min; 95 ℃，15 s。用2-ΔΔCT法计算相对表达水平，使用SPSS 26.0进行数据统计分析(α=0.05)。

表1 引物信息 Table 1 Primer information

1.4 肌间骨数量关联性SNP位点筛选

将测序获得的肌间骨数量极端个体scxa基因序列用DNAMAN进行多序列比对，获取突变位点；用Chromas分析突变位点的基因型，统计多肌间骨组和少肌间骨组在突变位点的基因型频率和等位基因频率；用SPSS 26.0计算基因型频率和等位基因频率与多(或少)肌间骨数目的显著性。使用SHEsis(http://analysis.bio-x.cn/)进行单倍型分析，并使用Cervus3.0对多态性位点进行遗传参数分析。

2 结果与分析

2.1 团头鲂scxa基因理化性质分析

团头鲂scxa基因开放阅读框为609 bp；编码202个氨基酸，分子式为C935H1511N297O308S8,分子质量为22.10 ku；理论等电点(pI值)为9.41，为碱性蛋白；氨基酸残基中Ser(14.4%)含量最高(图1)；不稳定系数为56.81，属于不稳定蛋白；脂肪系数为60.40，平均亲水性为-0.834，表明该蛋白为强亲水性，为可溶性蛋白；该蛋白不存在跨膜区域。

图1 团头鲂scxa基因氨基酸频率分布图

2.2 团头鲂scxa基因氨基酸序列分析

经同源性分析(图2)发现：团头鲂scxa基因氨基酸序列与鲫(75.40%)、鲤(74.60%)、金线鲃(73.41%)、斑马鱼(72.22%)scxa基因氨基酸序列同源性较高；scxa基因氨基酸序列存在79个保守的位点。从氨基酸序列比对分析发现，相对鸟类、哺乳动物等外群，鱼类scxa基因氨基酸序列中存在9个氨基酸缺失(图3)。使用MAGE X构建进化树(图4)，主要聚为3个分支：鱼类scx、鱼类scxa/b和其他动物scx。团头鲂scxa与鲤、鲫、斑马鱼和金线鲃同源性较高。聚类结果显示，鲤、鲫、金线鲃、斑马鱼和团头鲂聚为一类；斑点叉尾鮰、黄颡鱼聚为一类；半滑舌鳎、青鳉、红鳍东方鲀和尼罗罗非鱼聚为一类；原鸡、非洲爪蟾、牛、人、小鼠聚为一类。

1：鲫 Carassius auratus； 2：鲤 Cyprinus carpio； 3：金线鲃 Sinocyclocheilus grahami； 4：斑马鱼 Danio rerio； 5：纳氏锯脂鲤 Pygocentrus nattereri； 6：斑点叉尾鮰 Ictalurus punctatus； 7：墨西哥脂鲤 Astyanax mexicanus； 8：黄颡鱼 Tachysurus fulvidraco； 9：大西洋鲱 Clupea harengus； 10：大西洋鲑 Salmo salar； 11：斑点雀鳝 Lepisosteus oculatus； 12：美丽硬骨舌鱼 Scleropages formosus； 13：原鸡 Gallus gallus； 14：半滑舌鳎 Cynoglossus semilaevis； 15：尼罗罗非鱼 Oreochromis niloticus； 16：牛Bos taurus； 17：小鼠 Mus musculus； 18：人Homo sapiens； 19：青鳉 Oryzias latipes； 20：多育花岩鳉 Poeciliopsis prolifica； 21：红鳍东方鲀 Takifugu rubripes； 22：非洲爪蟾 Xenopus tropicalis.

黑色方框表示鱼类缺失的氨基酸序列。 The black box indicates the amino acid sequence missing from fish.

2.3 scxa基因在团头鲂不同组织的表达分析

定量表达分析结果显示，scxa在肌间骨和肌肉中表达量相对较高，与其他组织中的表达水平存在显著差异(P<0.05)，scxa基因在肌肉中的表达量显著高于在肌间骨中的表达量(P<0.05)(图5)。

图4 scx基因的系统发育树

1:肌间骨 Intermuscular bone; 2:肌肉 Muscle; 3:脑 Brain; 4:鳍 Fin; 5:心 Heart; 6:肝 Liver; 7:脾 Spleen; 8:肋骨 Rib.不同的小写字母表示scxa在不同组织中的差异显著性(P<0.05).Lowercase letters indicates the significant difference for scxa in the different tissues,respectively (P<0.05).

2.4 scxa基因多态性与团头鲂肌间骨数量的相关性

基于所检测的团头鲂群体，scxa基因在肌间骨较多和较少群体个体中的多态性位点信息如表2所示， 2个SNP位点和1个插入缺失位点的等位基因频率和基因型频率在2个极端群体存在显著性差异(P<0.05)。其中，SNP位点chr09_22667389位于第一外显子，chr09_22661743位于第二外显子；插入缺失位点chr09_22661345-chr09_22661344位于第二外显子(图6)。单倍型分析中，剔除频率小于3%的组合，共发现3种单倍型；其中Haplotype 1 频率(0.73)最高，Haplotype 2 频率(0.05)最低(表3)。chr09_22661743、chr09_22661345-22661344、chr09_22667389位点的多态性信息含量分别为0.239 2、0.246 1和0.258 3。统计结果显示，3个位点的观测杂合度的数值范围为0.087 0～0.238 1，期望杂合度的数值范围为0.284 6～0.311 2，无有效等位基因的数值范围为0.076 9～0.533 3(表4)。

图6 团头鲂scxa多态性位点定位信息

表2 团头鲂肌间骨数量性状显著相关突变位点信息 Table 2 The SNPs information related to the number traits of IBs in M. amblycephala scxa gene

表3 scxa基因外显子多态性位点单倍型分析 Table 3 Haplotype analysis of polymorphic sites in the exon of scxa gene

表4 scxa基因3个多态性位点的遗传参数 Table 4 Genetic parameters of 3 polymorphic loci in scxa gene

3 讨 论

本研究通过高通量测序和基因克隆技术获得团头鲂scxa基因的cDNA序列，通过ProParam进一步分析scxa基因的理化性质，为研究scxa基因对于团头鲂肌间骨发生发育的作用提供理论依据。对该基因编码的氨基酸序列分析发现，团头鲂scxa与鲤、鲫等鲤科鱼类scxa具有高度同源性，与其他物种的scxa同源性相对较低。而且scxa在不同进化地位的鱼类中也存在差异。另外，scxa存在79个氨基酸保守位点；鱼类的氨基酸序列相对于哺乳类存在一段9个氨基酸的缺失，推测这段缺失的氨基酸序列可能与物种所处的进化地位有关。

Nie等[21]研究发现scxa基因敲除斑马鱼肌间骨数量显著减少。本研究定量结果显示，scxa基因在团头鲂肌肉中的表达量最高，在肌间骨中表达量次之。已有研究表明，scx在哺乳动物肌腱发育中发挥了重要作用。例如，Sakabe等[23]发现scx基因缺失小鼠在发育过程中肌腱完全缺失，导致异位骨化现象；陈宇龙等[24]定量分析了团头鲂tnmd基因在团头鲂肌间骨发育过程的4个关键时期表达情况，结果表明tnmd基因的表达情况与肌间骨的发育存在同步性。Shukunami等[25]研究表明scx基因促进tnmd表达，正向调节肌腱细胞的分化和成熟。因此，我们可以推测scxa基因在鱼类肌间骨发育过程中发挥重要作用。

本研究在团头鲂scxa基因外显子上获得2个与多肌间骨数量性状相关的SNP位点，这2个位点均为转换类型。研究表明其转换发生概率通常比其他几个位点变异更高，这是因为细胞中胞嘧啶大多甲基化并自发除去氨基以形成胸腺嘧啶[26]。研究[27]表明基因编码区SNP在外显子上的突变率为其周围序列的1/5，但位于基因编码区的SNP突变会对该基因的表达产生潜在影响，从而可能对表型变化发挥作用。因此，编码区SNP对生物育种有重要意义。多态信息含量与杂合度是群体内遗传变异的测度，其值的高低反映了群体内个体的均质度，遗传变异大，数值就高。但由于不同标记得出的数值有很大的差异，Vaiman 等[28]提出了确定位点多态性的标准：PIC>0.5 为高度多态座位，PIC<0.25 为低度多态座位，0.25

INDEL是指在近缘种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序列发生不同大小核苷酸片段的插入或缺失，是同源序列比对产生空位的现象。INDEL分子标记在动植物遗传育种中得到了广泛应用[29]。本研究获得的chr09_22661345-chr09_22661344位点仅存在于多肌间骨个体中，并且该位点发生变异时， chr09_22667389、chr09_22661743分别也会产生变异，但这种连锁关系并不双向发生。由此推测，该位点的变异会影响其他多肌间骨关联性SNP位点的发生，但需要扩大样本做进一步验证。目前对于肌间骨发育关键基因上的SNP位点尚未有研究报道，但肌间骨数量相关SNP位点的筛选和应用将有助于快速活体检测鱼类肌间骨数量信息，相对于传统解剖学肌间骨计数法更加节省资源，从而促进相关育种研究的进展。