不同处理对蛭石栽培的微型薯疮痂病防控效果及其微生态效应分析

胡洪涛，朱志刚，周荣华，杨靖钟，蔡兴奎，颜冬冬

1.湖北省生物农药工程研究中心，武汉 430064； 2.华中农业大学园艺林学学院， 武汉 430070；3. 中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193

马铃薯是世界第三、中国第四大粮食作物，随着我国马铃薯主粮化战略的实施，马铃薯种植面积快速增加，我国已成为世界马铃薯生产和消费第一大国，年种植面积约560万hm2，年产量9 000多万t[1]，占世界马铃薯种植面积和产量的1/4左右，马铃薯产业健康发展对我国粮食安全至关重要。马铃薯不仅是我国第四大粮食作物，同时也是我国大多数山区经济欠发达县的主要栽培作物[2]，因此，马铃薯产业的健康可持续发展不仅关系到我国粮食安全，而且对国家乡村振兴战略顺利实施也至关重要。马铃薯疮痂病作为危害马铃薯重要病害之一，几乎在我国所有马铃薯产区均有发生，发生程度呈逐年加重趋势，尤其是在以蛭石为基质的脱毒微型薯生产基地，连作地种薯患病率高达50%以上，种薯商品价值丧失殆尽。但截至目前，我国尚无正式登记针对疮痂病的防治药剂，说明我国马铃薯疮痂病的防控措施严重缺乏[3]，亟待研究马铃薯疮痂病的防控方法和技术。

马铃薯疮痂病(potato common scab)最早于1890年在美国康涅狄格州被发现[4]，现在已成为世界性土传病害[5]，是马铃薯四大重要病害(晚疫病、粉痂病、疮痂病、病毒病)之一，感染该病的薯块表面会出现近圆形至不定形木栓化疮痂状淡褐色病斑或斑块，呈凹陷、凸起或平状，被害薯块品质、产量均显著降低，种薯失去商品价值。目前，马铃薯疮痂病在我国几乎所有马铃薯产区均有发生，一般田块发病率在30%左右，部分田块发病率高达50%以上[6]，连作田、干旱地区、温室种植的马铃薯发病更为严重。马铃薯由于易感病毒病，生产上多采用脱毒苗繁育而来的微型薯作为种子，而微型薯的生产多在以蛭石为基质的温室中进行，由于蛭石价格昂贵，为节约成本种薯繁育单位多将蛭石重复使用，导致疮痂病在种薯基地发生更为严重，发病率甚至高达80%以上[7-8]。由于无经济有效的防控措施，马铃薯疮痂病发生面积和程度不断加大，这不仅严重威胁着马铃薯种质资源安全，也阻碍了马铃薯产业的绿色健康发展。

马铃薯疮痂病由链霉菌(Streptomyces)侵染引起，目前报道导致马铃薯疮痂病的链霉菌有20多种，但大多数地区的致病菌以普通疮痂链霉菌为主[9-10]。疮痂链霉菌属于放线菌科链霉菌属、革兰氏阳性菌，此类菌大部分营腐生生活，也能感染除马铃薯外的多种根茎类作物，如甜菜、胡萝卜、花生等[11]。疮痂链霉菌能产生孢子并依靠孢子进行扩散、感染寄主，土壤pH 5.5～7.5、相对湿度小于60%～70%、温度20～22 ℃最有利于病原菌入侵[5]，而且马铃薯发病程度与块茎生长时间密切相关，生长2～3周的幼薯最为感病[12]，当块茎表面木栓化后，发病程度大为减轻。土壤微生物是土壤环境重要成分，在养分循环和植物生长中起着关键调控作用，而最近的研究发现马铃薯疮痂病的发生程度与土壤微生物组成和功能紧密相关[13]，尤其是与土壤致病性的疮痂链霉菌的丰度相关，说明降低土壤病原菌数量是控制马铃薯疮痂病的关键。土壤消毒是采用物理、化学等方法来杀灭土壤中的有害生物，从而控制土传性病害、害虫或者杂草的为害，其中以化学药剂溴甲烷消毒效果最好，但由于溴甲烷对臭氧层的破坏作用而被全球禁用。棉隆是近年来在全国大面积推广的消毒药剂，实践表明棉隆消毒对土传性真菌病害[14]、细菌病害[15]、线虫病害[16]、根肿病[17]等均有较好的防效，而采用棉隆土壤消毒对以蛭石为基质种植的马铃薯疮痂病的防控效果尚未见报道，同时也不清楚土壤消毒对蛭石中微生物的影响。为解决蛭石种植的马铃薯种薯繁育中疮痂病防控难题，我们进行棉隆土壤消毒联合生物菌剂试验，并利用16S核糖体高通量测序技术研究其对蛭石微生态影响。

1 材料与方法

1.1 材 料

1)供试品种。马铃薯品种为中薯5号。

2)供试药剂及主要试剂。98%棉隆细粒剂，江苏南通施壮化工有限公司；2×108孢子/mL青霉菌34107水剂，湖北省生物农药工程研究中心；5%中生菌素可湿性粉剂，福建凯立生物科技股份有限公司。土壤DNA提取试剂盒，美国MP Biomedicals公司；测序文库制备试剂盒、TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit，美国Illumina公司。

1.2 试验方法

1)微型薯疮痂病田间药效小区试验。试验在华中农业大学校内的微型薯繁育温室大棚内进行，设6个处理，98%棉隆消毒处理(225 kg/hm2)(T1)，2×108孢子/mL青霉菌34107灌根(600 kg/ hm2)(T2)，5%中生菌素灌根(500倍液)(T3)，98%棉隆消毒(225 kg/hm2)联合2×108孢子/mL青霉菌34107灌根(600 kg/ hm2)(T4)，98%棉隆消毒(225 kg/hm2)联合5%中生菌素灌根(500倍液)(T5)，并设空白对照(T6)。每个处理3个重复，共18个小区，小区长5 m、宽6 m，面积为30 m2，小区随机排列。于2020年6月18日进行棉隆土壤消毒试验，操作方法参照文献[17]，先将棉隆均匀撒到蛭石表面，然后采用小型旋耕机将棉隆翻入蛭石，浇水至60%左右的含水量后，盖膜，处理21 d后，揭膜敞气。微型薯组培苗播种时间为9月14日，播种后30 d，分别采用2×108孢子/mL青霉菌34107和5%中生菌素稀释液灌根。马铃薯收获时(11月28日)进行病害分级鉴定，分级标准和防治效果计算参照文献[18]。田间试验药效试验数据采用IBM SPSS 22.0软件、调用Duncan’s方法进行方差显著性分析。

2)样品采集和蛭石中基因组DNA提取。于马铃薯收获时，按照五点取样法采集蛭石样本，放入干冰,带回实验室后保存于-80 ℃冰箱。蛭石微生物基因组DNA提取按照厂家说明书执行。

3)16S 核糖体基因高通量测序和数据分析。细菌16S核糖体基因高通量测序以及数据分析参照文献[19]所述方法进行。简述如下，基因组DNA经检验合格后，利用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCA GCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGT WTCTAAT-3)引物对细菌16S核糖体基因V3-V4区进行扩增，然后上机进行测序，原始数据经质量过滤后，与GreenGenes数据库中的16S rRNA基因序列进行比对，以97%的相似性作为阈值进行OTU(operational taxonomic units)划分。采用PICRUSt软件[19]对细菌OTU与KEGG等数据库进行比对和分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理对微型薯疮痂病防控效果及经济效益分析

不同处理对微型薯疮痂病防控效果及经济效益分析详见表1。相比T6处理，各处理病情指数均显著降低(P<0.05)，以T4处理最低(1.73)，其次为T5(5.72)和T1(6.26)，随后是T2(10.73)，以T3处理最高(22.43)。种薯疮痂病防效以T4处理最高(93.43%)，其次为T5(88.27%)、T1(86.72%)、T2(74.51%)，这4个处理之间无显著差异(P<0.05)，以T3处理防效最低(65.10%)。商品薯数量以T4(348.3万个/hm2)、T5(334.1万个/hm2)、T1(326.1万个/hm2)最多，显著高于T2(226.5万个/hm2)和T3(156.6万个/hm2)(P<0.05)。产值和经济效益也以T4、T5和T1最高，显著高于其他处理。

表1 不同处理对种薯疮痂病防效及产量、经济分析 Table 1 Control effects of minituber common scab by different treatments and analysis of yields and economic profits

2.2 不同处理蛭石中细菌组成分析

不同处理蛭石中细菌组成详见图1。各处理蛭石中细菌均以变形菌门(Proteobacteria)相对丰度最高,为0.51～0.84；其次为放线菌门(Actinobacteria)，相对丰度在0.042～0.230，以T6最高、T4最低；随后为拟杆菌门(Bacteroidetes)，相对丰度为0.019～0.13，以T6最低、T4最高。

图1 不同处理蛭石中细菌在门水平组成

层次聚类分析显示(图2)，在属水平的细菌组成除T5和T6较为相似外，其余处理均有较大差异。在T2和T4处理中，假单胞杆菌属(Pseudomonas)丰度较高，但相对丰度低于T4处理；T5和T6处理细菌组成较为类似，均以鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)丰度较高；T1处理中以假单胞杆菌属、Mitsuaria、伴根瘤菌属(Pararhizobium)等丰度较高；T3处理中以硫化细菌属(Thiobacillus)和Saccharimonas丰度较高。

图2 蛭石中细菌在属水平的层次聚类分析

统计分析显示，185个属的丰度发生显著变化(P<0.05)(图3)。相对于T6，T1处理中112个属丰度显著性变化，其中38个属显著增加、74个属显著减少，丰度前三的属分别为Mitsuaria、Cellvibrio、Acidovorax，增加倍数最大的为Mitsuaria(FC，fold changes,倍数变化)=12.6)，玫瑰色半光合菌属(Roseateles,FC=11.6)，IMCC26134(FC=10.1)；显著性下降有74个属，丰度前三的是鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、类诺卡菌属(Nocardioides)、Pelomonas，下降倍数较大的是罗氏菌属(Rhodanobacter，FC=-14.8)、unclassified-Rhodanobacteraceae细菌(FC=-13.1)、Amycolatopsis(FC=-12.8)。T2中共有112个属显著变化，55个属显著性上升、57个属显著下降，其中，丰度前三的是假单胞杆菌属(Pseudomonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、德沃斯氏菌属(Devosia)，上升倍数较大的是食酸戴尔福特菌(Delftia，FC=11.4)、Leucobacter(FC=10.5)、Nitrosomonas(FC=10.1)；下降倍数较大的是Phycicoccus(FC=-11.3)、Humibacter(FC=-11.2)、Mizugakiibacter(FC=-10.2)。T3处理中有88个属丰度显著变化，其中29个属增加、59个属下降；丰度前三的分别是硫化细菌(Thiobacillus)、Saccharimonas、Domibacillus，丰度增加倍数最大是硫化细菌(FC=13.0)、嗜甲基菌属(Methylophilus，FC=11.9)、Parapusillimonas(FC=11.6)；下降倍数最大的是Rhodanobacter(FC=-14.8)、Pelomonas(FC=-14.4)、硝化螺旋菌(Nitrosospira，FC=-13.6)。T4处理中30个属丰度显著变化，均为显著增加，其中，丰度最高的是假单胞杆菌、Massilia、黃杆菌(Flavobacterium)，丰度变化最大的是嗜甲基菌属(Methylophilus，FC=10.4)、Pelagibacterium(FC=9.9)、Pseudacidovorax(FC=9.6)。T5处理中共58个属显著变化，其中25个显著增加、33个显著下降，丰度最高的3个属是不动杆菌属、Pelomonas、罗氏菌属，以Parapusillimonas(FC=8.3)、芽孢杆菌(Bacillus，FC=3.8)、Effusibacillus(FC=2.9)增加最多，而Humibacter(FC=-5.3)、Pseudoxanthomonas(FC=-2.7)、Conexibacter(FC=-2.2)减少最多。

图3 丰度发生显著变化的前10个属

2.3 不同处理对蛭石中细菌多样性的影响

不同处理对蛭石中细菌alpha多样性影响较大(图4)。相对于对照(T6)，棉隆处理(T1)和棉隆+中生菌素复合处理(T5)的蛭石细菌Chao1指数显著降低(P<0.05)；而青霉菌34107单独使用有所增加，棉隆+青霉菌34107复合处理有所降低，但都没有达到显著水平(P>0.05)。与Chao1指数类似，青霉菌34107处理蛭石Shannon指数有所增加，而棉隆+青霉菌34107处理有所降低，但均没有达到显著水平(P>0.05)；棉隆单独处理、棉隆+中生菌素复合处理蛭石细菌Shannon指数均显著降低(P<0.05)。

图4 不同处理蛭石细菌多样性指数

相对于T6(表2)，T1～T5分别有112、112、88、100和58个属显著变化，其中T2处理上调数量最多(55)、T5上调数量最少(25)；T1中下调数量最多(74)、T4处理下调最少(0)。在这些属当中，92个属(49.5%)存在于所有6个处理，仅少数(1～20)存在不同处理的交集中(图5)。

表2 不同处理丰度发生显著性变化属的数量 Table 2 Number of genera with significant changes in different treatments

图5 不同处理在属水平交集的数量

2.4 蛭石中链霉菌与其他细菌相关性分析

相关性分析(P<0.01，R>0.6)结果显示(图6)，蛭石中链霉菌丰度与55个属细菌呈显著正相关，相关性最大前5位分别是中慢生根瘤菌(Mesorhizobium，r=0.979 5)、Solirubrobacter(r=0.939 9)、Acidipila(r=0.939 0)、Ellin6067(r=0.937 4)、包层不黏柄菌(Asticcacaulis，r=0.936 3)，而与Dyadobacter(r=-0.783 2)、Pedobacter(r=-0.759 9)、Paenarthrobacter(r=-0.742 2)等8个属丰度呈显著负相关。

1.Mesorhizobium； 2.Solirubrobacter； 3.Acidipila； 4.Ellin 6067； 5.Asticcacaulis； 6.IMCC 26256； 7.Pelomonas； 8.Xanthobacter； 9.Sphingomonas； 10.Pseudolabrys； 11.Luteimonas； 12.Kribbella； 13.Unclassified-Sphingomonas； 14.Acinetobacter； 15.AKYG 1722； 16.Rhodanobacter； 17.Elstera； 18.Unclassified-Pedosphaeraceae； 19.Dyella； 20.Ideonella； 21.Polycyclovorans； 22.Methyloversatilis； 23.Jatrophihabitans； 24.Mizugakiibacter； 25.Tumebacillus； 26.Methylobacillus； 27.Unclassified-Rhodanobacter； 28.Geothrix； 29.Intrasporangium； 30.Nitrosospira； 31.Afipia； 32.Hyphomicrobium； 33.Luteibacter； 34.Micromonospora； 35.Rhizobium； 36.Terrabacter； 37.Nitrobacter； 38.Angustibacter； 39.Candidatus_Kaiserbacteria； 40.Arenimonas； 41.Longimicrobium； 42.Mycobacterium； 43.Gemmatimonas； 44.Unclassified-Vermiphilaceae； 45.Sporolactobacillus； 46.Promicromonospora； 47.Paucibacter； 48.Aquabacterium； 49.Marmoricola； 50.Effusibacillus； 51.Lysobacter； 52.Leifsonia； 53.Humibacter； 54.Amycolatopsis； 55.Nocardioides； 56.Methylophilus； 57.Microbacterium； 58.Achromobacter； 59.MM2； 60.Noviherbaspirillum； 61.Pedobacter； 62.Paenarthrobacter； 63.Dyadobacter.

3 讨 论

马铃薯疮痂病是既可种传、也可土传的病害，但蛭石栽培的脱毒微型薯疮痂病菌主要来源于蛭石菌。因此，清除蛭石中的病原菌对防控微型薯疮痂病非常关键。棉隆是一种广谱性农药，在土壤中能分解出异硫氰酸甲酯、甲醛和硫化氢等物质，对土壤中线虫、真菌、细菌等均有杀灭作用，实践证明其对生姜青枯病[15]等具有较好的效果，但对土壤微生物多样性和土壤酶活性有抑制作用[14]。本研究通过田间试验，探索棉隆消毒及与生物药剂配合使用对蛭石栽培微型薯疮痂病的防控效果，并对其微生态效应进行了分析。结果证明，棉隆消毒与青霉菌34107灌根联合使用，对微型薯疮痂病防控效果最好，高于棉隆与中生菌素联合使用，也高于单用棉隆，商品微型薯数量、产值和经济效益也明显增加。同时，蛭石中假单胞杆菌等有益微生物显著提升、微生态多样性也相比单用棉隆有显著提升，说明棉隆消毒与青霉菌联合使用防控蛭石栽培的微型薯疮痂病具有较好的经济和生态效应。由于蛭石栽培的微型薯疮痂病源主要来源于蛭石，因此，消灭蛭石中病原菌，对于防控该病非常关键。但单用棉隆消毒，可能不能完全杀灭蛭石中的病原菌，残存的病原菌可能会导致部分微型薯发病，而生物菌剂灌根可以起到抑制病原菌感染，同时也能促进土壤微生物多样性发展。所以，棉隆与生物菌剂联用取得较好的效果。长期以来，马铃薯疮痂病的防控主要以喷施农用硫酸链霉素为主，但由于交互抗性和环境食品安全等问题，2016年农业农村部已经严禁其在农业上应用。由于缺乏经济有效的防控方法，马铃薯疮痂病成为原种繁育的关键制约因子。本研究结果通过联合棉隆消毒和青霉菌生物防治对微型薯疮痂病取得较好的防效，对保障马铃薯原种繁育具有积极意义。

最近的研究发现，马铃薯疮痂病的发生与土壤细菌数量、种类和丰富度相关[20]，然而，本研究发现蛭石中变形菌门的数量在处理后无显著减少、反而有所增加，而与前人研究结果[20]相同的是，放线菌门数量有明显减少，放线菌门减少主要是链霉菌数量减少，链霉菌在对照处理中占比很高，达到3.23%，这可能是蛭石中疮痂病发生严重的关键因素[18]。通过相关性分析，我们发现链霉菌的丰度与55个属的细菌呈正相关，例如与中慢生根瘤菌的相关性达到0.979 5，呈极显著正相关(P<0.001)，说明疮痂病的发生与蛭石中微生物密切相关，并且可能是多种微生物互作的结果[13]。因此，对土传性病害的防控，不仅要减少病原菌的数量，同时也要恢复和重建健康土壤微生态，保持土壤微生态健康环境。