下调miR-221-5p靶向ALDH1A2基因增强鼻咽癌细胞对顺铂的敏感性

王平 赖闻 田松明

(重庆市两江新区第一人民医院耳鼻喉科，重庆 401121)

鼻咽癌是一种起源于人鼻咽部上皮组织的恶性肿瘤，属于头颈部癌，常见于东亚和东南亚[1]；其在我国东南部地区特别是广东省高度流行，治疗方案包括顺铂或5-氟尿嘧啶为主的放化疗方案及外科干预[2]。放化疗耐受是临床治疗失败的主要原因，研究鼻咽癌的化疗耐受靶点可为其治疗提供新的方向，减轻患者痛苦，提高生存率。研究[3]表明，miR-221在骨肉瘤细胞系MG-63、SaoS-2和U2OS中明显上调，miR-221的过表达促进骨肉瘤细胞的侵袭、迁移、增殖和顺铂耐药，抑制其表达可增强骨肉瘤细胞的顺铂敏感性。miR-221-5p在人鼻咽癌微环境癌相关成纤维细胞中上调表达[4]。生物信息学分析发现，乙醛脱氢酶1家族A2成员(Aldehyde dehydrogenase 1 family member A2，ALDH1A2)的3′UTR区含有与miR-221-5p互补的序列。ALDH1A2在高级别上皮性卵巢癌组织中表达低于低级别上皮性卵巢癌组织，其过表达可抑制上皮性卵巢癌细胞株的增殖和迁移，而ALDH1A2的下调显著增加了细胞的生长和迁移[5]。ALDH1A2在人结肠癌组织中表达下调，其过表达具有抑制结肠癌细胞增殖、克隆形成及侵袭的作用[6]。ALDH1A2与miR-221-5P在鼻咽癌中的表达和作用尚不清楚，对顺铂敏感性的影响也未可知。基于上述结果，本研究假设miR-221-5p可通过靶向ALDH1A2基因增加鼻咽癌细胞的顺铂敏感性，并对其进行验证。

1 材料与方法

1.1 材料 人永生化鼻咽上皮细胞NP69及人鼻咽癌细胞系SUNE1、HNE1和CNE2购自中国科学院上海细胞研究所，RPMI-1640培养基和胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司，顺铂(DDP)、RIPA裂解液、胰蛋白酶、溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)和二甲基亚矾(DMSO)购自美国Sigma-Aldrich公司，ALDH1A2抗体、CyclinD1抗体、Cleave-caspase-3抗体、MRP1抗体和β-actin抗体购自英国Abcam公司，Total RNA提取试剂盒、 real-time PCR 试剂盒、反转录试剂盒(RT-PCR)购自宝生物工程(大连)有限公司，引物、miR-221-5p mimics(miR-221-5p)、miR-221-5p抑制剂(anti-miR-221-5p)、ALDH1A2过表达载体(pcDNA-ALDH1A2)、ALDH1A2抑制物(si-ALDH1A2)、阴性对照(miR-con、anti-miR-con、pcDNA-con和si-con)及ALDH1A2野生型(WT)和突变型(MUT)双荧光报告质粒购自上海吉玛制药有限公司，Lipofectamine 2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，酶标仪、发光仪、显微镜及Real-time PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将人永生化鼻咽上皮细胞NP69、鼻咽癌细胞系SUNE1、HNE1和CNE2均培养于含10 % FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL 链霉素的RPMI-1640培养基中，在饱和湿度37 ℃、5%CO2密闭培养箱中常规培养。待细胞生长融合成一层时，洗涤，胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 细胞转染 收集对数生长期的SUNE1细胞，消化并计数，用培养液将细胞稀释为1×l06个/mL，接种于6孔板，继续培养至细胞融合度达80%～90%时进行转染，以不转染的细胞为NC组。根据Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书进行操作，将载体或片段转入SUNE1细胞。转染分组：miR-221-5p低表达组(转染anti-miR-con和anti-miR-221-5p)，ALDH1A2高表达组(转染pcDNA-con和pcDNA-ALDH1A2)，miR-221-5p高表达组(转染miR-con、miR-221-5p)，miR-221-5p和ALDH1A2低表达组(转染anti-miR-221-5p+si-con和anti-miR-221-5p+si-ALDH1A2)，ALDH1A2的野生型(WT)和突变型(MUT)双荧光素酶载体组(分别转染miR-con+WT，miR-221-5p+WT，miR-con+MUT，miR-221-5p+MUT)。转染48 h，收集细胞，验证转染结果，进行后续实验。

1.2.3 Real-time PCR检测RNA的表达 收集各组细胞，根据Total RNA提取试剂盒进行细胞总RNA的提取，检测浓度后按照反转录PCR试剂盒说明书反转录合成cDNA，取cDNA为模板进行 Real-time PCR反应，合成ALDH1A2 mRNA和miR-221-5p。反应程序为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s、59 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，45个循环；72 ℃5 min。运用2-ΔΔCt法进行数据分析。

1.2.4 MTT法测定细胞存活率和对顺铂半数抑制量(IC50) 收集各组对数生长期的SUNE1细胞，稀释后以2×103个细胞/孔接种于96孔板中，以不加DDP的细胞为空白对照，每孔加入不同浓度的DDP(终浓度分别为0.78125～50 μg/mL，倍比稀释)，在细胞生长至72 h时进行MTT实验，每孔加入 20 μL(5 mg/mL)MTT，培养4 h，弃上清，每孔再加入150 μL DMSO，室温震荡混匀10 min，酶标仪测定490 nm 吸光度(A)值。计算顺铂IC50值，细胞存活率=(A实验组-A空白对照组)/(A阴性对照组-A空白对照组)×100%。每孔3个平行，实验重复3次。

1.2.5 流式细胞术测定细胞凋亡率 收集各组SUNE1细胞，以每孔2×104个细胞接种于6孔板中，培养48 h，胰酶消化并收集细胞，进行洗涤细胞，根据 Annexin V/PI 试剂盒说明书进行操作，加入 200 μL binding buffer重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL 碘化丙啶(PI)混匀，避光室温孵育20 min，再加入 300 μL binding buffer，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6 Western blot检测蛋白表达 收集对数生长期的NP69细胞和各组鼻咽癌细胞，加入RIPA裂解液裂解细胞，超声破碎细胞，收集蛋白，测定蛋白浓度。取蛋白样本进行SDS-PAGE，用转膜仪将蛋白转PVDF膜，将膜用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入稀释的一抗(ALDH1A2抗体1∶1000、CyclinD1抗体1∶3000、Cleave-caspase-3抗体1∶2000、MRP1抗体1∶1000和β-actin抗体1∶4000)，4 ℃孵育过夜，洗膜3次，加入稀释的酶标二抗，室温孵育1 h，洗膜，显影拍照，以β-actin 为内参照，分析蛋白表达水平。

1.2.7 双荧光素酶报告实验 根据1.2.2进行SUNE1细胞培养和转染，将构建的ALDH1A2的野生型(WT)和突变型(MUT)双荧光素酶报告载体分别与miR-con或miR-221-5p共转染SUNE1细胞，转染后培养48 h，收集细胞并将细胞进行裂解，离心收集裂解上清，根据试剂盒进行操作，发光仪检测荧光素酶活性。以海肾荧光素酶活性为内参照，计算相对萤火虫荧光素酶活性。

2 结果

2.1 miR-221-5p、ALDH1A2 mRNA和ALDH1A2 蛋白在鼻咽癌细胞系和鼻咽上皮细胞中的表达量 与NP69组相比，SUNE1组、HNE1组和CNE2组鼻咽癌细胞中miR-221-5p的表达量均显著上升(P<0.05)，ALDH1A2 mRNA和蛋白的表达量均显著下降(P<0.05)，见图1和表1。miR-221-5p和ALDH1A2在3种鼻咽癌细胞株中的表达情况一致，后续实验选择SUNE1细胞进行研究。

图1 Western Blot 检测ALDH1A2蛋白的表达量

表1 miR-221-5p、ALDH1A2mRNA和ALDH1A2 蛋白在鼻咽癌细胞系和鼻咽上皮细胞中表达水平

2.2 低表达miR-221-5p抑制鼻咽癌细胞SUNE1增殖，诱导凋亡，增强对顺铂的敏感性 与NC组和anti-miR-con组相比，anti-miR-221-5p组miR-221-5p表达量显著下降(P<0.05)，Cleave-caspase-3表达量显著升高(P<0.05)，增殖相关蛋白CyclinD1和MRP1(多药耐药相关蛋白1)表达均降低(P<0.05)，细胞存活率显著下降(P<0.05)，细胞凋亡率显著升高(P<0.05)，顺铂半数抑制量(IC50)降低(P<0.05)，见图2和表2。

表2 低表达miR-221-5p抑制鼻咽癌细胞SUNE1增殖、诱导凋亡和增强对顺铂的敏感性

图2 低表达miR-221-5p抑制鼻咽癌细胞SUNE1增殖、诱导凋亡和增强对顺铂的敏感性

2.3 高表达ALDH1A2抑制鼻咽癌细胞SUNE1增殖，诱导凋亡，增强对顺铂的敏感性 与NC组和pcDNA-con组相比，pcDNA-ALDH1A2组ALDH1A2和Cleave-caspase-3表达量显著升高(P<0.05)，Cyclin D1和MRP1表达显著降低(P<0.05)，细胞存活率下降(P<0.05)，凋亡率上升(P<0.05)，顺铂半数抑制量(IC50)显著降低(P<0.05)，见图3和表3。

表3 高表达ALDH1A2抑制鼻咽癌细胞SUNE1增殖，诱导凋亡和增强对顺铂的敏感性

图3 高表达ALDH1A2抑制鼻咽癌细胞SUNE1增殖，诱导凋亡，增强对顺铂的敏感性

2.4 miR-221-5p靶向ALDH1A2 TargetScan预测结果显示，ALDH1A2的3′-UTR区含有与miR-221-5p互补的序列，见图4A。与miR-con组相比，miR-221-5p组ALDH1A2野生型WT的萤火虫荧光素酶相对活性显著下降(P<0.05)，而突变型MUT的萤火虫荧光素酶相对活性无明显变化，见表4。Western blot结果表明，与miR-con组相比，过表达miR-221-5p可使ALDH1A2蛋白表达量显著降低(P<0.05)；与anti-miR-con组相比，抑制miR-221-5p表达可使ALDH1A2蛋白表达量显著升高(P<0.05)，见图4 B和表5。说明miR-221-5p靶向负调控ALDH1A2的表达。

表4 miR-con或miR-221-5p与ALDH1A2报告质粒共转染SUNE1细胞后双荧光素酶活性检测

表5 Western Blot检测ALDH1A2的表达

图4 miR-221-5p靶向调控ALDH1A2表达

2.5 低表达ALDH1A2可部分逆转miR-221-5p低表达对SUNE1细胞增殖、凋亡以及顺铂敏感性的影响 抑制miR-221-5p可抑制SUNE1细胞增殖、促进凋亡和增强顺铂敏感性。与anti-miR-221-5p+si-con

组相比，anti-miR-221-5p+si-ALDH1A2组ALDH1A2和Cleave-caspase-3蛋白表达显著降低(P<0.05)，CyclinD1和MRP1蛋白表达显著升高(P<0.05)，细胞存活率显著上升(P<0.05)，凋亡率显著降低(P<0.05)，顺铂半数抑制量(IC50)显著升高(P<0.05)，见图5和表6。

图5 低表达ALDH1A2可部分逆转miR-221-5p低表达对SUNE1细胞增殖、凋亡以及顺铂敏感性的影响

表6 低表达ALDH1A2可部分逆转miR-221-5p低表达对SUNE1细胞增殖和凋亡以及顺铂敏感性的影响

3 讨论

顺铂(Cisplatin)是一种铂族金属抗癌化疗药物，是顺式-二氯二氨合铂的简称，常缩写为DDP，目前已广泛应用于治疗多种人恶性肿瘤，包括膀胱癌、头颈部癌、肺癌、卵巢癌和睾丸癌[7]。顺铂主要作用机制是基于其与DNA嘌呤的交联能力，干扰DNA修复机制，造成DNA损伤，进而诱导癌细胞凋亡；但由于其耐药性和不良副作用，顺铂常与其他药物联合治疗，以克服耐药性和减少毒性。鼻咽癌可发生顺铂耐药表型，靶向或阻断BEX3活性可能有助于逆转鼻咽癌顺铂耐药表型[8]。临床研究[9]表明，顺铂联合吉西他滨可延长复发或转移性鼻咽癌患者的无进展生存期，可作为该人群的标准一线治疗方案。

大量miRNA在鼻咽癌中表达异常，以肿瘤抑制因子或致癌因子的作用调控鼻咽癌的发生发展和耐药等过程，可为患者提供有用的预后生物标志物，为鼻咽癌治疗提供新的靶点[10-11]。miR-221-5p在前列腺癌、肾细胞癌组织和细胞系中表达上调，与癌细胞增殖、迁移和患者预后有关[12-13]。miR-221-5p在人乳腺癌微环境癌相关成纤维细胞中表达上调，可能参与了正常成纤维细胞向癌相关成纤维细胞的转化，并与癌相关成纤维细胞的增殖、黏附、侵袭、转移有密切关系[14]。有研究[4]表明，miR-221-5p在人鼻咽癌癌相关成纤维细胞中表达上调，可能与癌相关成纤维细胞的侵袭能力有关。miR-221-5p在鼻咽癌组织和细胞中的表达和作用尚不清楚。本研究发现，miR-221-5p在鼻咽癌细胞SUNE1、HNE1和CNE2中高表达，与前述结果[4]类似。抑制miR-221-5p表达可抑制鼻咽癌SUNE1细胞增殖和诱导细胞凋亡，并增强细胞的顺铂敏感性，说明miR-221-5p在鼻咽癌细胞增殖、凋亡和顺铂耐药性过程中发挥重要作用。

ALDH1A2又称乙醛脱氢酶(ALDH)1家族成员A2，是一种催化视黄醛合成视黄酸的酶，与ALDH1A1和ALDH1A3是三个高度保守的细胞同工酶，对脊椎动物成体器官和组织的正常生长、分化、发育和维持至关重要，是正常组织干细胞和肿瘤干细胞的标志物，参与自我更新、分化和自我保护[15]。ALDH1A2 在乳腺癌、卵巢癌、肝癌、胃癌和前列腺癌中表达异常，与患者总体生存率、癌细胞增殖、迁移、治疗靶点、预后等有关[16-20]。ALDH1A2表达与神经母细胞瘤患者预后不良显著相关，而且与异种神经母细胞瘤的生长和未分化以及神经母细胞瘤细胞对化疗药物13-顺式维甲酸的耐药有关[21]。ALDH1A2在鼻咽癌中的表达尚不清楚。

本研究结果发现，ALDH1A2在鼻咽癌细胞SUNE1、HNE1和CNE2中表达量均显著下调，双荧光素酶报告系统结果显示，miR-221-5p靶向负调控ALDH1A2的表达；进一步的实验结果表明，低表达ALDH1A2可部分逆转miR-221-5p低表达对SUNE1细胞增殖、凋亡以及顺铂敏感性的影响，说明miR-221-5p和ALDH1A2在鼻咽癌细胞中存在调控关系。另外，本研究通过TargetScan预测发现，ALDH1A2的3’-UTR序列中含有与miR-221-5p互补的核苷酸序列，提示两者存在调控关系，也提示ALDH1A2参与miR-221-5p对鼻咽癌增殖、凋亡和顺铂耐药性的调控。下一步将研究miR-221-5p和ALDH1A2在鼻咽癌患者中的表达，两者对肿瘤增殖、侵袭的影响，及对癌症分期和患者存活期的影响等，进一步探讨miR-221-5p和ALDH1A2在鼻咽癌临床中的作用。

4 结论

在鼻咽癌SUNE1细胞中，低表达miR-221-5p可靶向促进ALDH1A2表达，进而抑制鼻咽癌SUNE1细胞增殖和诱导细胞凋亡，并增强细胞的顺铂敏感性的作用机制；miR-221-5p可能是鼻咽癌潜在的化疗增敏靶点。