百合资源抗棉蚜性鉴定及遗传多样性分析

周俐宏，石 慧，杨迎东，崔玥晗，杨盼盼，徐雷锋，明 军*

（1.辽宁省农业科学院花卉研究所，沈阳 110161；2.中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081；3.沈阳农业大学植物保护学院，沈阳 110866）

百合（Liliumspp.）是世界上重要观赏花卉之一，在世界切花市场上占有重要地位。棉蚜（Aphis gossypiiGlover）是危害百合害虫之一，危害百合植株健康和观赏性，作为传播媒介更是百合病毒病主要诱因。目前，防治蚜虫多采用化学防治，但长期采用化学药剂，致使蚜虫逐渐产生群体抗药性，防治效果降低，迫使加大用药量和喷洒频率，增加生态环境风险[1]。培育抗蚜虫品种是有效解决蚜虫胁迫重要途径之一，获得抗蚜种质是实现抗虫育种目标前提和基础。因此，对百合种质资源开展抗蚜性评价，分析其遗传关系，可更有针对性选育抗蚜新品种，为抗虫材料综合应用和抗虫遗传研究提供参考。

目前植物抗蚜性鉴定已在马铃薯[2]、苜蓿[3]、芸薹属[4]、小麦[5]、菊属[6]、西瓜[7]、黄瓜[8]等作物上广泛应用。百合抗蚜研究比较薄弱[9]，亟待开展。SSR标记具有共显性、高度多态性、全基因组覆盖、重复性好等优点而被广泛应用。近年，随着百合转录组数据的获得，百合中SSR标记开发迅速发展[10]，500余条百合SSR引物已得到验证，在百合中表现高度多态性[11-12]。国内外学者已应用分子标记技术尤其是SSR标记技术对百合种间和种内遗传多样性以及依据遗传关系推测选择亲本开展相关研究[13-14]。但对不同抗蚜能力类群百合种质资源间遗传关系研究未见报道。

根据原产地和亲本来源不同，国际百合协会将百合分为9个种系[15]，本研究选用60份百合资源涵盖其中5个种系，对其开展抗蚜虫评价，选用严格筛选后的6对SSR引物作荧光标记，利用全自动基因分析仪检测多态性位点，分析不同抗蚜级别百合资源遗传多样性，以期为百合抗蚜育种亲本选择提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

抗蚜性鉴定从2017～2019年执行3个年度重复测试。每年5月初将60份百合资源，包括11份野生种、49份栽培品种定植于冷棚中，每年7月初鉴定抗蚜性。试验材料定植于辽宁省农业科学院花卉研究所西地试验地。

1.2 方法

1.2.1 百合资源抗棉蚜性鉴定

1.2.1.1 人工蚜虫接种

上午10点左右，用毛笔小心将棉蚜2龄若虫接种到蕾期植株顶部嫩叶上，每株接种5头，3次重复。接种10 d（蚜虫繁殖2代）时，调查供试植株上蚜虫数量。蚜虫接种和数量统计参照Deng等方法[16]。

1.2.1.2 抗蚜虫性评价

抗性评价采用蚜量比值法，蚜量比值=某材料蚜量/全部观察材料平均蚜量。根据百合蚜量比值不同，可将抗蚜性分为5级：高抗：0～0.25；抗虫：0.26～0.50；中抗：0.51～0.75；感虫：0.76～1.25；高感：1.25以上[16]。

1.2.2 抗感棉蚜资源遗传多样性分析

1.2.2.1 DNA提取与检测

每份材料选取幼嫩叶片1 g，MP Fastprep-24设备研磨，植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取基因组DNA，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。

1.2.2.2 PCR扩增与标记检测

根据Du等发表引物信息[12]，共选取50对SSR引物合成。对筛选出6对SSR标记（见表1）正向引物5'末端用FAM、HEX、TAMRA 3种荧光染料中一种作标记。引物合成和标记由上海生工生物工程股份有限公司完成。

表1 引物信息Table 1 Primer information

PCR扩增体系包含20μL反应体积，其中Taq聚合酶0.4μL、10×PCR buffer 2μL、正向引物和反向引物各0.5μL、dNTPs 1μL、基因组DNA 2μL和ddH2O 13.6μL。PCR反应程序为94℃5 min；94℃30 s，58℃45 s，72℃45 s，35个循环；72℃10 min，4℃保存。PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳检测，将电泳条带显示清晰PCR产物送上海生工生物工程股份有限公司作毛细管电泳荧光检测。

1.2.2.3 数据统计与分析

GenAIEx 6.51b2计算每对引物等位基因数（Allele number）、有效等位基因数（Effective allele number）、基因多样性指数（Gene diversity index，H）；Popgen32计算SSR引物主要等位基因频率（Major allele frequency）、Shannon信息指数（Shannon's Information index，I）；PIC_CALC计算多态性信息含量指数（Polymorphism information content，PIC）。在MEGA 6.06中构建遗传聚类图。

2 结果与分析

2.1 百合资源抗蚜性等级鉴定

2017～2019年利用人工蚜虫接种和蚜量比值法共鉴定72份百合资源，其中，60份资源抗蚜性能力表现稳定。根据蚜量比值法可分为5级（见图1、表2），31份资源为高抗材料，7份资源为抗虫材料，4份资源为中抗材料，6份资源为感虫材料，12份资源为高感材料。在31份高抗资源中，亚洲百合和麝香百合×亚洲百合杂交种占54.84%（见图2a），而这两个杂种系主要亲本是抗蚜野生种细叶百合、有斑百合、朝鲜百合、大花卷丹等[17]，说明亚洲百合杂种系和麝香百合杂种系是百合抗蚜育种重点资源。在12份高感百合资源中，东方百合和东方百合×喇叭百合杂交种占50%，野生种资源占41.67%（见图2b），东方百合和喇叭百合杂种系主要亲本为湖北百合、毛百合[17]，鉴定结果表明为感蚜种，说明东方百合杂种系是相对易感蚜虫百合资源。

图2 高抗蚜（a）和高感蚜（b）等级中不同类型百合资源Fig.2 Different types of lily resources in high resistance(a)and high susceptible(b)groups

表2 60份百合资源抗蚜性等级鉴定结果Table 2 Grades of aphid resistance of 60 lily resources

图1 百合资源5个抗蚜等级分级标准Fig.1 Five aphid-resistance grading standard in lily

续表2

2.2 百合种质资源SSR位点多样性分析

利用6对引物（见图3）在60份资源中共检测出35个等位基因，平均每对SSR引物扩增出5.8个主要等位变异，其中LS34扩增出等位变异最多，为9个。主要等位基因频率为0.1667～0.6250，平均0.3872。多态性信息含量（PIC）变幅介于0.5663～0.8940，平均0.7472，PIC最大标记为LS34，最小标记为LS15。6个位点PIC值均大于0.5，为高度多态性位点。基因多样性指数（H）变化为0.491～0.848，平均0.647，其中LS41最低，LS34最高。Shannon多 样 性 指 数 为1.3759～2.5319，平 均1.9231，最高为LS34，最低为LS15（见表3）。基因多样性指数、多态性信息含量、Shannon信息指数呈正相关，可反映每对标记鉴别能力。6个SSR位点多态性丰富，可检测到不同百合资源间丰富的遗传多样性。

图3 引物LS08 HEX在‘Starlight Express’（a）和‘Navona’（b）测序峰值Fig.3 Sequencing peak of‘Starlight Express’and‘Navona’with primer LS08 HEX

表3 6对SSR标记遗传参数Table 3 Genetic parameters of the six SSR markers used in this study

2.3 百合种质资源遗传多样性分析

利用6对引物分析不同抗蚜组百合资源遗传多样性（见表4），不同抗蚜组百合基因多样性指数、多态性信息含量、Shannon信息指数变化分别为0.538～0.852、0.795～0.908、0.861～1.883，平均值为0.722、0.876和1.346，其中高抗组百合遗传参数最高。说明高抗组百合遗传多样性较丰富，可从中挖掘优良基因用于品种改良。

表4 不同抗蚜组百合遗传多样性分析Table 4 Genetic diversity analysis of lily with different aphid resistance groups

利用Popgen 32计算不同抗性组百合种质间遗传相似性（见表5），结果表明，遗传距离变化为0.1309～0.5403，平均0.3306，遗传一致度变化为0.5826～0.8773，平均0.7267。其中，感虫组和高感组遗传距离最小（0.1309），遗传一致度最大（0.8773），亲缘关系较近。抗虫组和中抗组遗传距离最大（0.5403），遗传一致度最小（0.5826），亲缘关系较远。

表5 不同抗性组百合资源遗传一致度和遗传距离Table 5 Genetic identity and genetic distance of lily with different aphid resistance groups

基于UPGMA对不同抗性组百合资源聚类（见图4），将5个抗性组划分为3个组群（组群Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）。

图4 基于遗传距离不同抗性组百合资源聚类结果Fig.4 Cluster result of lily with different resistance groups based on genetic distance

图4 中组群Ⅰ将抗虫组归为一类。组群Ⅱ将高抗组和中抗组归为一类。组群Ⅲ将感虫组和高感组归为一类。聚类结果与遗传相似性分析结果一致，也进一步表明百合对蚜虫抗性与百合遗传背景间存在密切联系。

基于UPGMA对不同百合资源聚类（见图5），高抗、中抗、高感资源在3个组群中均有分布，抗虫资源主要分布在A组，感虫资源主要分布在A和B组。基于各抗感资源间遗传关系及距离，可为百合抗蚜育种提供更加详细参考。

图5 基于荧光SSR分子标记的60份百合资源聚类结果Fig.5 Cluster result of 60 lily resources based on data from SSR markers

3 讨论与结论

3.1 百合资源抗蚜性评价

本研究采用抗蚜性评价方法是蚜量比值法，在作物中具有通用性，可对不同作物间抗蚜水平开展横向比较。何俊平等鉴定32份切花菊抗蚜虫性，研究表明10个为高抗品种，占比31.25%，14个为不抗品种，占比43.75%[1]。王仕伟等鉴定222份玉米自交系蚜虫抗性，筛选出15份高抗蚜虫自交系，占比6.76%，35份高感蚜虫自交系，占比15.77%[18]。Zhang等鉴定21份西瓜资源抗蚜性，获得2份中抗资源，占比9.52%，3份高感资源，占比14.29%[19]。本研究鉴定72份百合资源抗蚜性，获得高抗资源31份，占比43.06%，12份高感资源，占比16.67%。可看出，百合抗蚜性水平高于其他作物。蚜虫胁迫受气候环境影响较大，为更加准确评价百合资源抗蚜性，需充分考虑不同年份对百合资源抗蚜差异的影响。周俐宏等对31份百合资源开展抗蚜性分级[9]，在随后两年重复评价中，有23份资源抗性水平表现稳定，8份资源抗性水平表现不稳定（已舍弃）。本研究开展连续3年重复评价，60份资源为抗性表现稳定（野生）品种，增强研究结果可靠性。

优异抗性资源是植物抗虫育种基础[20]。本研究中，细叶百合、有斑百合、条叶百合、岷江百合、朝鲜百合、大花卷丹为对蚜虫有一定抗性的野生种。据文献记载，细叶百合、朝鲜百合、大花卷丹、条叶百合均为亚洲百合杂种系亲本材料[17,21-22]，直接证明抗蚜百合类型中亚洲百合占主导地位（见图2）。而岷江百合作为喇叭型百合杂种系主要亲本材料[17,23]，也增加部分OT类型百合抗蚜性（见图2）。

3.2 百合SSR位点及抗蚜种质资源遗传多样性分析

Lee等基于百合属EST数据库开发首批百合SSR标记，利用19个标记在84份材料中检测到188个等位变异，平均每个标记等位变异数为9.95个，平均PIC为0.76[24]。Yamamoto等利用8个SSR标记检测236份L.auratumvar.auratumLindl.和L.auratumvar.platyphyllumBaker百合在日本不同地区遗传多样性，平均每个位点检测到2.80～4.86个等位变异，平均Nei氏遗传多样性为0.49～0.58[25]。本研究选用6对SSR引物分析60份不同抗蚜能力百合资源，多态性信息含量为0.5663～0.8940，平均0.7472，按照Botstein等提出衡量指标[26]，当PIC＞0.5时，该位点为高度多态位点，试验所用6对SSR引物均为高度多态位点。本研究所用SSR标记与前人研究结果相比表现较高遗传多样性，这与本试验引物经两次筛选，引物多态性高和荧光SSR标记检测分辨率更高、准确性更好有关，这些位点较好反映不同抗蚜级别百合资源遗传多样性。

刘冬云利用12对SSR引物分析25个细叶百合居群遗传多样性，结果表明，野生细叶百合居群在分子水平上表现丰富遗传多样性[27]。杨敏利用6对SSR引物分析长江中游地区野生百合种质资源遗传多样性，结果表明，长江中游地区百合野生种遗传分化程度较高[28]。葛亮等利用19对ESTSSR引物，将百合22个原生种和74个品种分为两个类群[13]。Lee等利用SSR和IRAP标记分析来自韩国、中国和日本二倍体和三倍体卷丹群体遗传多样性，结果表明，同源三倍体卷丹来源于小数量二倍体卷丹种[14]。国内外开展百合遗传多样性和群体结构分析较多，本研究比较5个抗蚜等级百合资源遗传多样性，不同抗蚜等级百合资源蕴含比较丰富遗传变异，显示较高水平基因多样性。不同抗蚜组百合资源间遗传多样性水平存在一定差异，高抗蚜组百合遗传多样性高于其他抗性组。聚类分析结果表明，高抗蚜组百合并不独立成群，在各组群中分布一致，这也与百合高度杂合基因特性有关。高抗蚜百合具有更高遗传多样性，可为百合抗蚜新品种选育过程中挖掘优良基因和拓宽遗传基础提供重要价值。

3.3 百合抗蚜育种亲本选择推测

利用百合资源遗传多样性和亲缘关系，可为从百合种质资源中高效发掘有利基因/QTL提供参考，达到育成有效抵御各种生物、非生物胁迫等新品种的目的。对观赏百合抗蚜育种来说，亲本选配标准不仅要考虑亲缘关系远近，还综合考虑亲本抗蚜能力及观赏性。抗蚜观赏百合育种亲本选配的依据是选用综合性状优的抗蚜百合和生态型相近或相同，但无亲缘关系广泛应用的商业品种杂交，可获得良好效果。本研究分析百合资源抗蚜性鉴定和遗传关系结果可为百合抗蚜育种提供参考。例如，可选择综合性状较优的抗蚜百合‘Prato’‘White Heaven’‘Fangio’等与观赏价值较高的‘Navona’‘Corcovado’‘Cocossa’杂交培育抗蚜切花百合；可选择综合性状较优的盆花抗蚜百合‘After Eight’与观赏价值较高的‘Pink Palace’杂交培育抗蚜盆花百合。此外，作为中国传统食用百合的兰州百合和卷丹均为高感蚜百合种，急需改造。结合百合资源间遗传关系（见图4），可用高抗细叶百合改造兰州百合，抗蚜条叶百合和朝鲜百合改造卷丹。