PD-1与PD-L1在儿童骨肉瘤组织中的表达及其临床意义

马立霜，李 萌

骨肉瘤是儿童群体中最常见的成骨性恶性肿瘤，原发于骨组织，恶性程度高，侵袭性强，预后较差［1］。骨肉瘤可在短时间内发生肺部转移，发生肺部转移的患者5年生存率不到20%，致残率、致死率非常之高。目前临床需要影像学对骨肉瘤进行辅助诊断，但多数仍需手术切除病变骨组织进行病理证实，早期诊断手段非常局限［2］。细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）［3］是白细胞的亚群，为一种特异T细胞，专门分泌各种细胞因子参与免疫作用，对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用，与自然杀伤细胞构成机体抗病毒、抗肿瘤免疫的重要防线。程序性死亡受体1（programmed death receptor 1，PD-1）是CTL细胞表达的一种免疫抑制性受体，肿瘤细胞能够表达PD-1的配体程序性死亡受体配体1（programmed death receptor ligand1，PD-L1），PD-1与PD-L1结合可激活CTL胞内抑制性信号，引发免疫抑制反应，导致肿瘤细胞免疫逃逸［4］。现如今关于骨肉瘤的发生发展过程及生物学规律还未探明，免疫系统的失调可能参与骨肉瘤的发病机制。大量的研究表明［5-7］，多种肿瘤组织中的PD-1和PD-L1表达与肿瘤患者分期和预后相关。笔者采用免疫组织化学（IHC）方法检测儿童骨肉瘤组织PD-1和PD-L1的表达，以判断PD-1和PD-L1与患者临床特征的关系，探讨其与骨肉瘤预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2018年1月—2020年1月在笔者医院接受手术治疗的24例儿童骨肉瘤患者作为研究对象，均经病理活检证实患骨肉瘤，手术切除的24例骨肉瘤制作成组织标本。14例男性患者，10例女性患者，年龄5~16岁，平均（10.5±4.3）岁。收集临床资料并进行出院后电话随访。个人基本资料包括年龄、性别、首发症状、肿瘤部位、肿瘤直径、病理类型、TNM分期。随访截止日期为2019年1月。纳入标准：年龄≤16岁；行骨肉瘤根治术；需经组织病理学确诊为骨肉瘤；未合并其他肿瘤；术前未进行任何放化疗及靶向治疗。排除标准：合并严重心脑血管疾病或其他系统疾病患者；合并其他严重肿瘤患者。该研究已获得医院伦理委员会批准，并取得所有患者及其家属的知情同意。

1.2 样本收集及测定兔抗人PD-1和PD-L1单克隆抗体（abl74838）购自英国Abcam公司，免疫组化方法涉及的其他试剂均购自福州迈新公司。骨肉瘤组织标本，常规石蜡包埋组织标本，切片、脱蜡、染色等免疫组化实验步骤需严格按照试剂盒说明书进行：（1）骨肉瘤组织蜡块4μm厚切片；（2）二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化；（3）3%过氧化氢室温孵育10 min，消除内源性过氧化物酶（peroxidase）的活性；（4）先进行蒸馏水冲洗，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）浸泡5 min，并进行2次；（5）pH8.0的乙二胺四乙酸（EDTA）0.5 mol/L进行微波抗原修复10 min；（6）使用5%正常山羊血清封闭，室温孵育10 min，倾去血清，勿洗，滴加一抗工作液，37℃孵育1 h；（7）PBS冲洗，5 min，并进行3次；（8）滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育30 min；（9）PBS冲洗，5 min，并进行3次；（10）滴加适量碱性磷酸酶标记的链霉卵白素（SABC）工作液，37℃孵育30 min；（11）PBS冲 洗，5 min，并进行3次；（12）免疫组化染色DAB室温显色3 min；（13）使用蒸馏水充分冲洗，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

PD-L1、PD-1阳性物为棕黄色颗粒，均定位于细胞膜和细胞质。在光镜下（×400）10个视野计数，每个视野计数100个细胞。根据肿瘤细胞中阳性细胞所占百分比（A）和染色强度（B）两个方面进行分析：（1）阳性细胞所占百分比（A）：0分为无阳性细胞，1分为阳性细胞百分比≤25%，2分为阳性细胞百分比26%~50%，3分为阳性细胞百分比51%~75%，4分为阳性细胞百分比≥76%；（2）染色强度（B）：0分为无染色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。AB相乘结果≥1表示结果为阳性。

分析PD-1和PD-L1与患者性别、首发症状、肿瘤部位、肿瘤直径、病理类型、TNM分期数的相关性。TNM分期参照美国癌症联合委员会（AJCC）TNM分期系统。

通过电话、复查方式得到患者无疾病生存期（disease-free survival，DFS）即从确诊骨肉瘤至肿瘤复发或转移或最后一次随访的时间。随访截止时间为2020年1月。

1.3 统计学分析采用SPSS 22.0统计学软件进行数据处理，计量资料采用（±s）表示，组间比较采用t检验；PD-1和PD-L1与患者年龄、性别、首发症状、肿瘤部位、肿瘤直径、病理类型、TNM分期的相关性分析采用χ2检验；使用Kaplan-Meier方法对骨肉瘤患者无疾病生存期进行生存分析；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PD-1和PD-L1表达与骨肉瘤患者临床特征的相关性表1显示：PD-1和PD-L1阳性表达与阴性表达与患者年龄、性别、首发症状、肿瘤部位、肿瘤直径、病理类型、TNM分期无明显相关性（P＞0.05）。PD-1在细胞膜和细胞质上低表达，PD-L1在细胞膜和细胞质上高表达；见图1，图2。

图1 、2见封三。

图1 PD-1免疫组化图片（×400）

图2 PD-L1免疫组化图片（×400）

表1 PD-1和PD-L1表达与骨肉瘤患者临床特征的相关性［例（%）］

2.2 骨肉瘤组织中PD-1/PD-L1与患者无疾病生存期的关系通过Kaplan-Meier方法进行生存分析24个月无疾病生存期，PD-1阳性表达与阴性表达的无疾病生存期比较差异无统计学意义（P=0.618）；PD-L1阳性表达与阴性表达的无疾病生存期比较，差异有统计学意义（P=0.001）。见图3、图4。

图3 、4见封三。

图3 儿童骨肉瘤患者PD-1阳/阴性表达的24个月生存曲线

图4 儿童骨肉瘤患者PD-L1阳/阴性表达的24个月生存曲线

3 讨论

骨肉瘤是一种侵袭性强、患者预后差的原发性恶性肿瘤［8］，可发病于各个年龄段，但最常见于儿童，是威胁我国儿童健康的主要恶性肿瘤之一。骨肉瘤与其他恶性肿瘤一样，在初期具有隐匿性，典型的临床症状和体征（压痛疼痛、关节肿胀、有肿块、活动受限等）在疾病早期发现比较困难，患者就诊时大多已到中晚期。骨肉瘤外科手术治疗预后差，并且对患者的生活质量造成较大的影响。新辅助化疗方案即术前化疗+外科手术+术后化疗［9］，这种方案使得骨肉瘤患者预后得到较大改善。该研究探讨骨肉瘤分子水平发病机制，对骨肉瘤的早期诊断和治疗具有重要意义。

该研究提示，PD-1和PD-L1阳性表达与患者性别、首发症状、肿瘤部位、肿瘤直径、病理类型、TNM分期无明显相关性（P＞0.05），与蓝瑞隆等［9］的研究结果一致。但在骨外骨肉瘤、鼻咽癌［4］、结直肠癌［10］组织的PD-1和PD-L1的表达研究中，发现PD-L1的阳性表达与临床分期有关。而该研究结果可能与所纳入的样本量有较大的关系，需要进一步加大样本量进行试验来证实。PD-L1阳性表达与患者的无疾病生存期（DFS）有关，PD-1阳性表达与患者的DFS无明显相关性，可能是因为骨肉瘤细胞在多种细胞因子的作用下高表达PD-L1，PD-L1的高表达可诱导骨肉瘤患者体内T淋巴细胞的凋亡并增强癌细胞的转移能力而导致病死率上升［11］，形成恶性循环，改变骨肉瘤细胞的微环境，由此推测PD-L1可以作为患者预后的标志。

综上所述，PD-L1的阳性表达与儿童骨肉瘤患者的DFS有关，可作为判断患者预后的标志。另外对PD-1/PD-L1通路的研究，可为骨肉瘤病理诊断和临床治疗提供参考，为靶肿瘤精准化治疗提供有力保障［12］。通过个体化应用PD-1/PD-L1免疫抑制剂，并且调整免疫抑制剂剂量，修饰并矫正宿主免疫反应，直接靶向肿瘤细胞对于骨肉瘤患者治疗更为高效。