靛玉红对角质形成细胞中促炎细胞因子表达水平的影响

李青雯，刘守刚，林静霞，陈永锋

1.南方医科大学，广东 广州 510515；2.南方医科大学皮肤病医院，广东 广州 510091

银屑病是一种慢性炎症性皮肤疾病，其主要特征是角质形成细胞的异常增殖和炎症介质(包括促炎细胞因子)的产生［1-2］。近年来，青黛膏作为临床治疗银屑病的常用方剂，对银屑病具有显著疗效［3-4］，其治疗银屑病的作用得到了越来越多的关注，但治疗机制却不完全清楚。为探究青黛膏治疗银屑病的机制，本研究采用青黛膏的主要成分靛玉红刺激HaCaT细胞，了解其对促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达的影响，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞来源与试剂

人类永生化角质形成细胞株HaCaT细胞(上海冉再生物科技有限公司)。靛玉红(北京索莱宝科技有限公司)，Human IL-1βELISA Kit(Raybiotech，广州)，Human IL-6 ELISA Kit(Raybiotech，广州)，Human TNF-αELISA Kit(Raybiotech，广州)，DMEM(美国Thermo Scientific公司)，胎牛血清(美国Thermo Scientific公司)，胰酶(美国Thermo Scientific公司)，上下游引物(上海生工)，PrimeScript® RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，日本)，TB Green® Premix Ex Taq®(Tli RNaseH Plus)，Bulk(Takara，日本)。

1.2 主要仪器

NanoDrop One分光光度计(美国Thermo Scientific公司)，ABI ProFlex PCR系统梯度基因扩增仪(上海旦鼎国际贸易有限公司)，CFX Connect实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)，酶标仪(美国Bio-Rad公司)，二氧化碳培养箱(Thermo Electron Corpo-Ration，Steri-cycle CO2Incubator)。

1.3 实验方法

1.3.1 HaCaT细胞复苏培养、铺板复苏HaCaT细胞，完全培养基(90% DMEM+10% FBS)培养细胞，在37℃、5%CO2条件的二氧化碳培养箱中孵育培养，在倒置显微镜下观察细胞生长状态，弃除旧培养基后用PBS洗涤细胞，加入3 mL胰蛋白酶消化细胞，放入37℃培养箱中孵育6 min，待细胞分离后加入3倍胰酶体积(约9 mL)含血清的新鲜培养基终止消化，转移至15 mL离心管中，以1 000 rpm/min的速度离心5 min，弃上清后加入新鲜培养基重悬细胞，进行细胞计数后将细胞稀释至2×105个/mL，准备好2块6孔板，每孔加入1 mL重悬的细胞悬液均匀铺板，放入二氧化碳培养箱中培养。

1.3.2 靛玉红处理细胞待细胞贴壁生长4～6 h后，按照以下分组加入靛玉红或DMEM培养基：A组(对照组，每组3个复孔)仅加入2 mL DMEM完全培养基，B、C、D组(实验组，每组3个复孔)分别加入0.5μM、1.0μM、2.0μM浓度的靛玉红(用DMEM稀释)，继续培养。

1.3.3 RT-qPCR检测HaCaT细胞中IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达水平继续培养48 h后，收集细胞，提取细胞内总RNA，按照试剂盒说明书进行反转录、qPCR反应。qPCR反应总体系25μL，含12.5μL TB Green Premix Ex TaGⅡ、2μL cDNA、8.5μL DEPC水、前后引物各1μL，反应条件为：95℃3 min；95℃10 s，56℃30 s，75℃30 s，共40个循环；65℃5 s、95℃50 s，绘制融解曲线。反应结束后，分析反应的扩增曲线及融解曲线无异常后，使用2-ΔΔCT法计算出各组细胞IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA的相对表达量。

1.3.4 ELISA检测HaCaT细胞培养上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌水平继续培养48 h后，收集HaCaT细胞培养上清液，ELISA检测IL-1β、IL-6、TNF-α的水平，实验步骤严格按照ELISA检测试剂盒说明书操作，最后在酶标仪中读取各孔在450 nm波长处的OD值，根据标准曲线计算样品中IL-1β、IL-6、TNF-α的浓度。

1.4 统计学处理

采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差表示，结果至少经三次独立重复试验计算得出。不同浓度靛玉红处理组与对照组之间IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达水平及细胞因子分泌水平的比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 靛玉红对HaCaT细胞中各促炎细胞因子mRNA表达水平的影响

与A组相比较，B、C、D组HaCaT细胞中促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达水平均明显降低，差异均具有统计学意义(图1)。且随着靛玉红浓度的升高，该抑制作用增强，呈一定的浓度依赖性。

图1 靛玉红处理后各组IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达水平Figure 1 Expression levels of IL-1β，IL-6 and TNF-αmRNA in each group after indirubin treatment．

2.2 靛玉红对HaCaT细胞培养上清液中各促炎细胞因子分泌水平的影响

与A组相比较，B、C、D组HaCaT细胞培养上清液中促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α分泌水平均明显降低，差异均具有统计学意义(图2)。且随着靛玉红浓度的升高，该抑制作用增强，呈一定的浓度依赖性。

图2 靛玉红处理后各组IL-1β、IL-6、TNF-α分泌水平Figure 2 Secretion levels of IL-1β，IL-6 and TNF-αin each group after indirubin treatment．

3 讨论

银屑病是一种多基因遗传背景下、免疫介导的慢性炎症性皮肤病，其主要特征是角质形成细胞的异常增殖分化和炎症介质包括促炎细胞因子的产生［5-6］。有研究发现，与正常皮肤组织相比，银屑病患者皮损中促炎细胞因子包括IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平明显升高［7-8］。IL-6主要是由内皮细胞分泌，其表达水平增高会导致Th17细胞与Treg细胞之间的平衡失调从而参与银屑病的发病［9］。IL-1β是由活化的单核/巨噬细胞、淋巴细胞等产生，通过与IL-1受体结合后发挥免疫调节、介导炎症的作用，参与了银屑病典型皮损的形成［10］。TNF-α主要由活化的巨噬细胞、NK细胞、T淋巴细胞产生。TNF-α抑制剂是一种治疗银屑病的有效生物制剂，包括了阿达木单抗、英夫利昔单抗等，已在临床上广泛应用［11］。

银屑病，中医称之为“白疕”，临床辨证中多从血论治，而尤以血热证多见［12］。根据中医“清热凉血”的理论，经临床总结、摸索，青黛膏(由青黛、白凡士林组成)可以有效用于治疗本病。青黛具有清热解毒、凉血消斑之功，是临床上用于治疗银屑病的常用中药，具有明确的疗效［13-14］。Lin等［3］研究发现，青黛通过抑制表皮角质形成细胞的异常增殖并促进其分化从而发挥治疗银屑病的作用，并且鉴定了靛玉红是其发挥作用的主要活性成分。HaCaT细胞是人永生化角质形成细胞株，与角质形成细胞具有相似的增殖、分化特性，且具有永生性，与银屑病角质形成细胞异常增殖分化的病理特征相似。前期研究观察到，青黛的主要成分靛玉红具有抑制HaCaT细胞增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡的作用，并且可以通过降低HaCaT细胞中角蛋白17的表达发挥调节HaCaT细胞分化、改善异常分化的作用［15］。本研究选取HaCaT细胞作为研究对象，在体外培养的HaCaT细胞株中加入青黛的主要活性成分靛玉红，设置不同的浓度梯度，结果发现：不同浓度的靛玉红处理后，HaCaT细胞中促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达水平及培养上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌水平均受到明显抑制，并且随着靛玉红浓度的升高，该抑制作用增强，呈一定的浓度依赖性。研究结论进一步验证了前人研究结果，提示靛玉红可能通过调控角质形成细胞的异常增殖及分化过程从而发挥治疗银屑病的作用。

综上所述，青黛膏的主要活性成分靛玉红可能通过降低HaCaT细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α等银屑病相关炎性因子的水平，从而发挥治疗银屑病的作用，但其具体机制还需进一步的动物及临床实验予以验证。