茜草制诃子对中国黄羽鹌鹑法氏囊T-bet与GATA-3表达量的影响

张雨凝 何敏 韦靖婧 郭熙艳

摘要： 为探索茜草制诃子对免疫抑制中国黄羽鹌鹑法氏囊T-bet及GATA-3表达量的影响，以茜草制诃子为研究对象，选用160羽21日龄健康中国黄羽鹌鹑，随机分为8组，进行临床观察、苏木精-伊红（HE）染色、荧光定量PCR等试验。临床观察结果显示，诃子组及茜草制诃子组平均日增质量增幅较空白组略小，但较阴性组增幅明显较大。各组法氏囊HE染色结果显示，诃子组及茜草制诃子组相较于空白组淋巴滤泡面积减小、法氏囊皱襞高度降低，但均优于阴性组。T-bet和GATA-3表达量趋势均为空白组>茜草制诃子2 g/kg组>诃子1 g/kg组>茜草制诃子4 g/kg组>茜草制诃子1 g/kg组>诃子2 g/kg组>诃子4 g/kg组>阴性组。说明，诃子及茜草制诃子均对免疫抑制中国黄羽鹌鹑法氏囊的免疫功能有恢复作用，茜草制诃子治疗效果优于诃子。研究结果为探索关于治疗免疫抑制疾病、提高動物自身免疫功能的药物提供了一些理论依据。

关键词： 茜草制诃子;免疫抑制;中国黄羽鹌鹑;法氏囊

中图分类号： R285.5 文献标识码： A 文章编号： 1000-4440（2021）03-0704-06

Effects of Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula on expression of T-bet and GATA-3 in bursa of Fabricius of Chinese Yellow Quail

ZHANG Yu-ning1，2， HE Min1，2， WEI Jing-jing1，2， GUO Xi-yan1，2

（1.College of Veterinary Medicine， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China;2.Key Laboratory of Animal Diseases and Human Health of Sichuan Province， Chengdu 611130， China）

Abstract：To explore the effect of Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula on the expression of T-bet and GATA-3 in bursa of Fabricius of immunosuppressed Chinese Yellow Quail， Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula was used as the research object， 160 21-day-old Chinese Yellow Quails were randomly divided into eight groups to do clinical observation， hematoxylin-eosin （HE） staining， fluorescence quantitative PCR and other experiments. Results of clinical observation showed that， the daily weight gains of Terminalia chebula group and Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula group were slightly lower than that of blank group， but were obviously higher than that of negative group. HE staining results of bursa of Fabricius showed that， compared with the blank group， the area of lymphoid follicle and the height of Fabricius plica of Terminalia chebula group and Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula group decreased， but they were improved compared with the negative group. The expression trends of T-bet and GATA-3 were blank group> Rubia cordifolia L per Terminalia chebula 2 g/kg group> Terminalia chebula 1 g/kg group > Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula 4 g/kg group> Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula 1 g/kg group> Terminalia chebula 2 g/kg group> Terminalia chebula 4 g/kg group> negative group. The results show that both Terminalia chebula and Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula can recover the immunosuppressed bursa of Fabricius of Chinese Yellow Quail， and compared with Terminalia chebula， Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula has a better effect. It provides some theoretical basis for the exploration of drugs for treating immunosuppressive diseases and improving animal autoimmunity.

Key words： Rubia cordifolia L. per Terminalia chebula;immunosuppression;Chinese Yellow Quail;bursa of Fabricius

茜草（Rubia cordiforlia L.）为植物茜草的干燥根和茎[1]。诃子（Terminalia chebula）为使君子科植物诃子或绒毛诃子的干燥成熟果实[2]。诃子作为主药、茜草作为辅药的配伍炮制方法在藏药方剂中早有记录[3]，两者可相辅相成。中国黄羽鹌鹑（Chinese Yellow Quail）是经选育培养成功的品种，因其生命力强、生长快、抗病性强等特点，在育种、生产、经济等方面都具有很高的价值[4]。法氏囊（Bursa of Fabricius， BF）作为禽类特有的中枢免疫器官，现有研究主要集中于其结构与功能发育、免疫功能的调控以及传染性法氏囊病[5]。虽然人们已对禽类广泛接种各类型疫苗进行传染病防治，但生产实践中仍然有免疫抑制病大面积暴发，给养殖业造成巨大的经济损失[6]。

T-bet主要表达于T细胞特别是Th1细胞;GATA-3表达于Th2细胞，正性调控Th2发育[7-8]。T-bet与GATA-3的表达量往往被分别用来代表Th1及Th2的表达水平，T-bet与GATA-3的比值也同时用来反映Th1与Th2的比值，Th1/Th2可决定机体免疫反应的类型[8-9]。通过研究Th1/Th2细胞亚群漂移状态与疾病的关系及其发生机制，我们能够选择性地调节Th1或Th2的表达水平，逆转其漂移状态，从而达到治疗某些特定疾病的目的[10]。

目前诃子及诃子炮制品对于免疫系统影响的研究还不完善，针对茜草制诃子的研究较少，更未有以鹌鹑法氏囊为主体的研究。本试验通过对中国黄羽鹌鹑注射环磷酰胺形成免疫抑制状态，再分别通过灌胃中国黄羽鹌鹑诃子或茜草制诃子来进行治疗，进行临床观察、HE染色法（苏木精-伊红染色法）、荧光定量PCR等试验，研究茜草制诃子对免疫抑制中国黄羽鹌鹑法氏囊的影响，为探索关于治疗免疫抑制疾病、提高动物自身免疫功能的药物提供一些理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 21日龄中国黄羽鹌鹑160羽（雌雄各半），购自成都市大安鹌鹑养殖社。

1.1.2 试验药物 诃子、茜草购于成都荷花池中药材市场，均由四川农业大学生药学教师范巧佳副教授通过品种鉴别、质量和纯度分析鉴定为使君子科植物诃子（Terminalia chebula）和茜草科植物茜草（Rubia cordifolia L.），环磷酰胺购自源叶生物有限公司。

1.1.3 主要试剂与仪器 苏木精-伊红（HE）染液购自索来宝生物科技有限公司;荧光定量PCR试剂盒购自诺唯赞生物科技股份有限公司。

石蜡切片机（RM2235型）、光学显微镜（BX53型）、烘箱（DHG-9140A型）、显微成像系统（BX61VS型）、数显电热恒温水浴箱（HH-S6型）、荧光定量PCR仪（LightCycler 96型）等。

1.2 试验方法

1.2.1 动物分组及饲养管理 试验选用160羽21日龄健康中国黄羽鹌鹑，随机分为8组，每组20羽，分别为空白组、阴性组、诃子1 g/kg组、诃子2 g/kg组、诃子4 g/kg组、茜草制诃子1 g/kg组、茜草制诃子2 g/kg组及茜草制诃子4 g/kg组，具体处理见表1。试验期为10 d，试验前所有处理的中国黄羽鹌鹑按笼称质量，计算初始平均体质量，用于计算给药剂量。1～3 d除空白组外其他组按每羽80 mg/kg剂量肌肉注射环磷酰胺，空白组注射等量生理盐水。4～10 d全部停止注射，诃子组及茜草制诃子组按3个不同药量分别灌胃诃子或茜草制诃子，空白组与阴性组灌胃等量生理盐水。试验期间自由采食与饮水，以上药物灌胃量以及环磷酰胺注射量均参考前人研究结果[11-12]。

1.2.2 临床观察 试验期间每天09∶00对中国黄羽鹌鹑的精神状况、活动情况进行临床观察。试验过程中以单个笼为单位记录各组中国黄羽鹌鹑平均日增质量变化。

1.2.3 HE染色 每组抽取3羽中国黄羽鹌鹑后采集法氏囊，用4%多聚甲醛固定，制作常规石蜡组织切片进行HE染色。利用光学显微镜，在400倍视野下观察法氏囊结构变化。应用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统，在100倍视野下，对各组法氏囊的皱襞高度以及淋巴滤泡的面积进行测量。

1.2.4 荧光定量PCR检测T-bet及GATA-3表达量变化 据荧光定量PCR对引物的要求，利用NCBI在线资源查找GATA-3、T-bet和β-actin的基因序列，以β-actin为内参基因，设计并合成引物（表2），每组抽取3羽中国黄羽鹌鹑并摘取法氏囊，冷冻研磨法氏囊组织，并进行RNA的提取。參照PrimeScriptTMRT试剂盒说明书将提取的RNA反转录合成cDNA，得到cDNA后，参照购买公司说明书具体步骤进行免疫相关基因的荧光定量PCR检测，计算相对表达量。

1.3 数据处理

用SPSS 20.0分析软件进行数据统计、分析，数据以平均数±标准差（SD）表示，P≤0.05时认为有统计学意义，0.05

2 结果与分析

2.1 临床观察

2.1.1 生长状况 中国黄羽鹌鹑试验期间空白组采食饮水、活动状况、精神状态均表现良好;注射环磷酰胺期间，除空白组外均出现喜卧现象;灌胃相应剂量诃子或茜草制诃子后，诃子处理组及茜草制诃子处理组精神恢复正常，活动状况良好，眼观两组间无明显区别。

2.1.2 平均日增质量 各组中国黄羽鹌鹑平均日增质量见表3，空白组平均日增质量总体呈上升趋势。注射环磷酰胺期间，从第2 d开始除空白组外其他各组平均日增质量明显下降。停止注射后，阴性组出现负增长且回升缓慢，诃子组及茜草制诃子组随着灌胃期延长平均日增质量相较于阴性组回升较快。各组每日增质量具体变化有差异，但总体呈现增长趋势，最后1 d平均日增质量均高于阴性组。

2.2 法氏囊HE染色

空白组（图1A）法氏囊组织结构完整清晰，淋巴滤泡大多数呈长椭圆形，少数为不规则多边形，皮髓质分界清晰，淋巴细胞排列较清晰。与空白组相比，阴性组（图1B）组织结构缩小甚至出现空洞，法氏囊皱襞排列稀疏，无明显淋巴滤泡结构且皮质和髓质不可分辨，淋巴细胞明显减少。

诃子1 g/kg组（图1C）法氏囊组织结构完整清晰，淋巴滤泡呈长椭圆形且结构规则，皮髓质分界清晰，淋巴细胞排列较清晰，眼观淋巴细胞少于空白组。诃子2 g/kg组（图2D）与诃子1 g/kg组相比，淋巴滤泡排列稀疏且体积缩小，间质增宽。诃子4 g/kg组（图1E）淋巴滤泡为不规则多边形，皮质和髓质边界已很难区分，间质结构疏松紊乱且出现退化，淋巴细胞减少，其状态更趋近于阴性组法氏囊。

茜草制诃子1 g/kg组（图1F）法氏囊组织结构完整，淋巴细胞排列清晰。茜草制诃子2 g/kg组（图1G）法氏囊与空白组相近，与空白组相比淋巴滤泡面积较小，与茜草制诃子1 g/kg组相比皮质增厚，淋巴细胞增多。茜草制诃子4 g/kg组（图1H）与茜草制诃子2 g/kg组相比法氏囊内细胞明显减少，皮质变薄，染色偏浅。

各组间法氏囊皱襞的高度及淋巴滤泡面积趋势（表4）均为空白组>茜草制诃子2 g/kg组>诃子1 g/kg组>茜草制诃子4 g/kg组>茜草制诃子1 g/kg组>诃子2 g/kg组>诃子4 g/kg组>阴性组。其中在法氏囊皱襞高度上，空白组比阴性组极显著升高（P<0.01），诃子1 g/kg组、茜草制诃子各组比阴性组显著升高（P<0.05）。在法氏囊淋巴滤泡面积上，空白组、诃子1 g/kg组比阴性组极显著增大（P<0.01），茜草制诃子2 g/kg组、茜草制诃子4 g/kg组比阴性组显著增大（P<0.05）。

2.3 荧光定量PCR检测T-bet及GATA-3表达量变化

由表5可知，T-bet 与GATA-3表达量的组间变化趋势相一致，即空白组>茜草制诃子2 g/kg组>诃子1 g/kg组>茜草制诃子4 g/kg组>茜草制诃子1 g/kg组>诃子2 g/kg组>诃子4 g/kg组>阴性组。其中，茜草制诃子1 g/kg组T-bet表达量比阴性组极显著升高（P<0.01），除茜草制诃子4 g/kg组与诃子4 g/kg组外，其他处理组T-bet表达量均比阴性组显著升高（P<0.05）。诃子1 g/kg组、诃子2 g/kg组GATA-3表达量比阴性组极显著升高（P<0.01），其他组GATA-3表达量与阴性组对比均显著升高（P<0.05）。

3 讨论

3.1 法氏囊HE染色

环磷酰胺具有较强的免疫抑制作用，对B淋巴细胞的抑制作用明显[13]，可使法氏囊皮质变薄，皮质内淋巴细胞减少，皮髓分界不清[14]。本试验中阴性组法氏囊结构变化均可与以上已有报道相对应，证明本试验过程中环磷酰胺对中国黄羽鹌鹑形成的免疫抑制效果明显。反观诃子组与茜草制诃子组法氏囊微观结构，虽不及空白组，但均优于阴性组且差异显著，表明诃子与茜草制诃子均可促进法氏囊组织结构的恢复。中药中含有多种营养物质、免疫活性物质和抗菌物质，可通过促进免疫细胞活性来增强家禽的免疫功能[15-17]。推测诃子及茜草制诃子中含有的某些成分改善了法氏囊组织结构，提高了免疫功能。

具体比较诃子组与茜草制诃子组，由于未经炮制的诃子具有一定的毒性，故在本试验中诃子组法氏囊皱襞的高度以及淋巴滤泡的面积与剂量呈负相关。在临床观察中发现，诃子2g/kg、诃子4g/kg 2个剂量组在第4 d平均日增质量出现负增长。推测是诃子具有免疫增强的作用，但动物机体免疫机制被激活后，会使部分营养素用于免疫反应和抵抗疾病，而不是用于生长，也就是在免疫功能增强的状态下，动物机体分解代谢水平升高[18-19]。但茜草制诃子组在增强免疫的过程中没有出现体质量负增长，是因为茜草制诃子经过炮制后诃子中鞣质或多酚含量发生变化，也或许是茜草与诃子相互作用生成了某种新成分，使药效增强并且减少诃子直接入药带来的副作用[20]。由此可见，茜草制诃子对中国黄羽鹌鹑法氏囊的药效比诃子更明显。

3.2 荧光定量PCR检测结果分析

3.2.1 荧光定量PCR检测法氏囊T-bet及GATA-3表达量变化 试验中，诃子及茜草制诃子组T-bet及GATA-3各自的相对表达量虽不及空白组但均高于阴性组，证明诃子及茜草制诃子均可在一定程度上缓解环磷酰胺对T-bet及GATA-3表达的抑制作用。因为诃子及茜草制诃子含有减轻环磷酰胺对基因损伤作用的成分，并可以促進基因的自我修复，具有增强机体抗氧化能力等功效[21-22]。

虽然中药可以减轻环磷酰胺对基因造成的损伤，但中药剂量过大会导致药物毒副作用增大[23]。故本试验中诃子虽然有拮抗环磷酰胺的作用，但随着诃子用药剂量的增加其副作用也逐渐增大，T-bet及GATA-3的相对表达量与药剂用量呈现反比。反观茜草制诃子组，在2 g/kg剂量下T-bet及GATA-3表达量最高，虽然茜草制诃子4 g/kg组的表达量也有所下降，但其表达量均高于诃子2 g/kg组以及诃子4 g/kg组。这是由于药物炮制是传统中药汤剂制作过程中的重要环节，科学合理的药物炮制不仅可以降低药材内所含的毒性成分，还可使药物的疗效得到有效提升[24-26]。

3.2.2 对比中国黄羽鹌鹑法氏囊T-bet及GATA-3的表达量 Th2类细胞主要介导体液免疫，而法氏囊中的B淋巴细胞参与并介导体液免疫，故各组GATA-3的表达量要高于T-bet的表达量。但在诃子组中对比T-bet和GATA-3的表达量可以发现，T-bet与GATA-3的比值越来越大，甚至诃子4 g/kg组T-bet的表达量高于GATA-3的表达量。推测未经过炮制的诃子对中国黄羽鹌鹑的调节可能更偏向于Th1方向。

反观茜草制诃子组，可以发现茜草制诃子各组GATA-3的表达量均高于T-bet的表达量。也可推测，未经炮制的诃子其药物副作用对于体液免疫的影响更为明显，故导致诃子组T-bet与GATA-3的比值与剂量呈正相关，进而导致Th1/Th2的漂移偏向于Th1。茜草制诃子可使漂移偏向于Th2是因为GATA-3可通过促进Th2细胞中IL-4、IL-10和IL-13的表达以活化STAT6来进一步增强GATA-3的表达，并通过抑制IL-12和INF-γ的信号转导来抑制Th1细胞发育[27-29]，甚至将GATA-3转入在Th1诱导环境下的T细胞中或者是已经终末分化的Th1细胞中也能导致Th2细胞特异性的染色质重塑[30-31]。

4 结论

诃子与茜草制诃子对免疫抑制中国黄羽鹌鹑法氏囊的免疫功能均有促进作用，但诃子未经炮制会对动物机体有一定的毒副作用，随着剂量的增加毒副作用增强，而诃子经过茜草炮制后其毒副作用有所降低，且茜草制诃子对法氏囊免疫功能的促进作用优于诃子。本研究是对茜草制诃子研究的补充，也可为探索关于治疗免疫抑制疾病、提高动物自身免疫功能的药物提供一些理论依据。

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（責任编辑：陈海霞）