LINC01088对卵巢癌SKOV3细胞增殖、迁移与侵袭的调控作用及机制*

汤亚兰，唐方祥，陆茜林，张若兰，刘 康，岳秋菊，徐 凡，胡辉权，李 均

[川北医学院第二临床医学院(南充市中心医院) a.妇产科;b.组织工程与干细胞研究所，南充 637000]

卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，发病率和死亡率均较高[1]。近年来，卵巢癌的规范化治疗和全程管理逐渐被重视，其治疗取得了巨大进步。然而，早期症状隐匿、复发和转移是卵巢癌临床治疗失败的主要原因，也是导致患者死亡的关键因素[2]。因此，寻找卵巢癌生物学功能相关基因，探讨卵巢癌侵袭转移机制，以提高卵巢癌诊断率、降低患者死亡率，显得尤为重要。长基因间非编码RNA 1088(LINC01088)是长链非编码RNA的1种，位于染色体4q21.21，全长1.0kb。近期研究表明[3]，LINC01088能促进非小细胞肺癌的增殖，但LINC01088在卵巢癌发生发展中的作用机制仍不明确。本研究拟探讨LINC01088对卵巢癌SKOV3细胞增殖、迁移、侵袭及上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的影响，以明确LINC01088在卵巢癌发生发展中可能发挥的作用，为卵巢癌发病提供新的理论基础和实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料 人卵巢癌细胞系SKOV3、CAOV3和人正常卵巢细胞ISEO80均购自北京北纳创联生物技术研究院。LINC01088引物及U6内参引物由成都擎科生物科技有限公司合成。LINC01088引物：正向5'-CCTGGCTATCCTGGAGTTTTC-3'，反向：5'-TCATATCAGGGACAGGGCTTA-3';U6内参：正向5'-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3'，反向5'-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3'。LINC01088过表达质粒及空载质粒构建、慢病毒载体(GV367载体、AgeI/NheI酶切)包装、浓缩、纯化、滴度检测及重组病毒上清液的收集均由上海吉凯基因化学技术有限公司完成。E-cadherin抗体、Vimentin抗体、Akt抗体、PI3K抗体、p-Akt 473抗体、p-PI3K抗体及GAPDH内参均购自杭州华安生物技术有限公司。TRIzol Reagent购自美国Ambion公司，逆转录试剂盒及2×SYBR Green qPCR Mix试剂盒均购自美国Thermo公司。CCK-8试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;Transwell小室购自美国Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 实时定量PCR法检测LINC01088 mRNA表达水平 收集对数生长期SKOV3、CAOV3、ISEO80细胞，参照Trizol说明书提取细胞总RNA，根据逆转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增，检测3株细胞中LINC01088 mRNA的表达量。所有反应均设有3个复孔，采用SYBR Green嵌合荧光方法在荧光定量PCR仪(Bio-Rad公司)上扩增目的基因和内参基因。用2-ΔΔCt法计算LINC01088 mRNA相对表达量。

1.2.2 细胞感染及感染效率的检测 将对数生长期SKOV3细胞按3×105细胞/孔接种于6孔板，培养24h，待细胞融合至50%左右时，根据预实验结果，MOI=10分别加入病毒上清液，感染细胞8h后换液，48h后荧光显微镜观察感染效率，待感染效率达80%时，用嘌呤霉素筛选感染成功的SKOV3细胞并获得稳转细胞株用于后续试验。通过qRT-PCR法鉴定慢病毒过表达效果。稳定感染LV-LINC01088的SKOV3细胞作为实验组(LV-LINC01088组)，感染携带无意义序列空载慢病毒的SKOV3细胞作为阴性对照组(LV-NC组)，同时将未感染的SKOV3细胞设为空白对照组(Control组)。

1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖能力 取上述3组SKOV3细胞，胰蛋白酶消化后收集细胞，培养液重悬，调整细胞密度为5×104细胞/ml，按100μL/孔接种于96孔板，每组均设置5个复孔，于37℃、5% CO2培养箱培养。分别在培养1、2、3、4、5d时加CCK-8法检测试剂,10μL/孔，继续培养1h，设置酶标仪于波长450nm处检测各孔OD值，并绘制细胞生长曲线，OD值越大表示活细胞数越多，细胞增殖越快。实验重复3次。

1.2.4 细胞划痕实验检测细胞迁移能力 在6孔板底部外侧均匀划标记线(宽0.5mm)，取上述3组SKOV3细胞，胰蛋白酶消化后收集细胞，培养液重悬，调整细胞密度为1.5×105细胞/mL，按2mL/孔接种于6孔板，接种24h后用无菌的200μL移液枪枪头垂直在6孔板底部划线，划痕与标记线垂直，尽量保证每个划痕宽度一致。无菌PBS洗去悬浮细胞，显微镜观察并拍照。吸去PBS并加含2%胎牛血清的MyCoy's 5A培养基，继续培养24h，显微镜观察细胞迁移情况并拍照，测量迁移距离，计算迁移率，迁移率(%)=迁移距离/划痕距离×100%。实验重复3次。

1.2.5 Transwell实验 取Transwell小室置于24孔板，将上述3组SKOV3细胞，胰蛋白酶消化，PBS洗2遍，用无血清的MyCoy's 5A培养基重悬，调整细胞密度为5×105细胞/mL。迁移试验：取上述重悬细胞，上室加200μL细胞悬液，下室加500μL含15%胎牛血清的MyCoy's 5A培养基。培养48h，取出小室，棉签擦拭上室细胞，4%多聚甲醛固定20min，0.4%结晶紫染色15min，显微镜下随机取5个视野计数迁移细胞数目并取平均值。侵袭试验：将基质胶(matrigel)与无血清MyCoy's 5A培养基按1∶8稀释后，均匀铺在Transwell小室底部膜的上室面(70μL)，室温干燥后待用。上室加上述细胞悬液100μL，下室内加700μL含15%胎牛血清的MyCoy's 5A培养基。常规培养48h，弃小室内液体，后续操作同迁移试验，所有实验重复3次。

1.2.6 Western blot检测相关蛋白表达水平 分别提取3组细胞总蛋白，BCA蛋白浓度测试盒测定并将样品调定至统一浓度，加蛋白上样缓冲液，沸水煮5min使蛋白变性，分装-80℃保存。取12μg总蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭1h，分别加入用快速抗体稀释液稀释的特异性一抗:E-Cadherin、Vimentin，Akt、PI3K、p-Akt 473、p-PI3K、GAPDH，4℃过夜。次日，用PBST洗涤4次，2.5%脱脂奶粉封闭1h孵育，用PBST再次洗涤4次，电化学发光试剂盒显色，经曝光、显影、定影后照相，以GAPDH为内参，观察各组EMT相关蛋白及PI3K/Akt信号转导通路相关蛋白的表达情况。

2 结 果

2.1 LINC01088在卵巢癌SKOV3细胞中表达下调 qRT-PCR结果显示，卵巢癌细胞SKOV3和CAOV3中LINC01088 mRNA表达量分别是1.02±0.48和1.82±0.12，正常卵巢细胞ISEO80中LINC01088 mRNA表达量是4.66±1.97。相比正常卵巢细胞，SKOV3细胞中LINC01088 mRNA表达明显下调，差异有统计学意义(t=12.234，P<0.001)，故选择SKOV3细胞进行后续研究。

2.2 慢病毒过表达LINC01088对SKOV3细胞的感染效率 空白对照组和阴性对照组SKOV3细胞中LINC01088 mRNA相对表达量分别为1.00±0.12和1.01±0.19，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。实验组SKOV3细胞中LINC01088 mRNA相对表达量26.64±2.89，明显高于阴性对照组(1.01±0.19)，差异有统计学意义(t=22.27，P<0.05)，提示携带LINC01088序列的重组慢病毒感染SKOV3细胞成功。

2.3 LINC01088对SKOV3细胞增殖的影响 CCK-8法检测结果显示，随着培养时间的延长，3组细胞的OD值均逐渐升高，与空白对照组和阴性对照组相比，实验组2～5天OD值均较低，且差异有统计学意义(P<0.05)。提示过表达LINC01088能抑制SKOV3细胞的增殖，见图1。

图1 过表达LINC01088对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响

2.4 LINC01088对SKOV3细胞迁移的影响 体外细胞划痕实验检测显示，划痕后培养24h，LV-LINC01088组的细胞迁移率明显低于LV-NC组和Control组，差异有统计学意义(P<0.001)，见表1。表明LINC01088能抑制SKOV3细胞的迁移。

2.5 Transwell实验检测过表达LINC01088对SKOV3细胞迁移和侵袭的影响 体外Transwell实验表明,过表达LINC01088抑制卵巢癌SKOV3细胞的迁移和侵袭，差异有统计学意义(P<0.001)。见表1。

表1 过表达LINC01088对SKOV3细胞迁移和侵袭的影响

2.6 LINC01088对SKOV3细胞EMT相关蛋白表达的影响 Western blot法结果显示，相比LV-NC组和Control组，LV-LINC01088组的E-cadherin表达升高，Vimentin表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。过表达LINC01088可抑制SKOV3细胞的EMT过程。

图2 过表达LINC01088对SKOV3细胞中E-cadherin和Vimentin蛋白表达的影响

2.7 LINC01088对SKOV3细胞PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响 3组细胞PI3K和Akt蛋白的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，LV-LINC01088组p-PI3K和p-Akt 473蛋白的表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。SKOV3细胞中，过表达LINC01088可抑制PI3K/Akt信号转导通路活化。见图3。

3 讨 论

据全球癌症数据显示[4]，2018年全球新增29.5万例卵巢癌病例，18.5万例妇女死于卵巢癌。手术联合化疗仍是目前卵巢癌主要的治疗方式，尽管靶向和生物药物治疗给卵巢癌患者带来了新的希望，但目前尚无证据表明卵巢癌是可以被治愈的。卵巢癌的发生发展与基因表达和肿瘤相关信号通路的异常密切相关。因此，人们尝试从以上两方面探索卵巢癌的病因，并寻找其治疗的新靶点。

RNA是“中心法则”最重要的中间体[5]，在人庞大的基因组中，大多数RNA被转录并呈现出一种发育样式的调节。新近研究发现[6]，人类转录组中存在大量反义、重叠的非编码RNA，其执行的功能远比蛋白编码基因及它们的剪切变体复杂，可能在细胞的发育和代谢中发挥重要作用[7]。长链非编码RNA(lncRNA)是非编码RNA的一种，其长度大于200nt，不参与编码蛋白[8]，既往认为其是转录的“噪音”，然而随着研究的不断深入，发现lncRNA具有基因组印记、转录组调控等一系列生物学功能，这些功能的破坏或失调在肿瘤的发生中起到了关键的作用。Ai等[9]研究发现，LINC01088在卵巢癌组织中表达下调，其高表达患者的预后较好，是卵巢癌患者预后的独立预测因子。Zhang等[10]研究发现，LINC01088在良性卵巢肿瘤中表达下调，可能通过LINC01088/miR-24-1-5p/PAK4轴抑制卵巢上皮细胞肿瘤的发生。由此推测LINC01088在卵巢癌中可能发挥抑癌基因作用，通过qRT-PCR技术检测发现LINC01088在卵巢癌细胞中表达下调，过表达LINC01088后，SKOV3细胞的增殖、迁移及侵袭明显受到抑制，这与既往研究结果一致。然而，导致这一现象的具体作用机制仍不清楚，需进一步探索。

EMT是指上皮来源细胞在特定的生理和病理条件下向间质细胞发生转化的一种现象，EMT现象与肿瘤的侵袭转移密切相关，在众多肿瘤(包括卵巢癌)的原位浸润和远处转移中发挥重要作用[11]。EMT整个过程包括细胞形态和基因型两方面的改变，表现为细胞黏附分子(如E-cadherin)表达减少，失去细胞间相互作用；上皮细胞外形演变为梭形间质细胞形态，细胞角蛋白结构发生改变；获得了某些间质细胞特性，如Vimentin等间质特性蛋白表达上调[12]。本研究结果显示，过表达LINC01088后SKOV3细胞E-cadherin蛋白表达水平显著升高，而Vimentin蛋白表达水平显著降低，表明SKOV3细胞EMT过程受到抑制，这可能是导致细胞增殖、迁移和侵袭受到抑制的原因。

PI3K/Akt是调控EMT的关键信号通路之一，活化的Akt具有多种生物学活性，可促进肿瘤细胞生长、增殖、转移及诱导EMT[13]。过表达LINC01088后，SKOV3细胞的EMT过程受到抑制。进一步研究发现PI3K/Akt信号通路相关蛋白p-Akt473、p-PI3K表达降低，可见PI3K/Akt信号转导通路受到抑制，其可能是LINC01088抑制SKOV3细胞EMT过程的关键因素。LINC01088可能通过使PIP3脱磷酸化为PIP2而成为PI3K/Akt信号通路的主要负性调节因子之一。现已证实，过表达LINC01088抑制PI3K/Akt信号转导通路活化，从而抑制SKOV3细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT。可见LINC01088/PI3K/Akt信号转导通路的失调与卵巢癌的发生、转移及EMT过程密切相关。但是LINC01088/PI3K/Akt通路的机制是复杂的，需进一步研究。

综上所述，本研究从体外实验角度，提示过表达LINC01088通过阻断PI3K/Akt信号通路下调了EMT相关蛋白的表达，能抑制SKOV3细胞的增殖、迁移和侵袭，相关研究可进一步在体内实验荷瘤裸鼠模型和人样本组织病理学验证，LINC01088有望成为卵巢癌治疗的新靶点。