miR-301b-3p在甘孜高原藏区子痫前期患者血浆中的表达及其临床意义

亮 亮，咱呷拉姆，曲 拥，何国琳,徐立彦

(1.甘孜藏族自治州人民医院妇产科，康定 626000；2.甘孜藏族自治州石渠县人民医院，石渠 627350；3.四川大学华西第二医院产科，成都 610041)

妊娠期高血压疾病(hypertensive disorders complicating pregnancy，HDCP)是孕产妇常见疾病，在我国的患病率约为7.6%，并呈现北方高于南方[1]，高海拔地区高于低海拔地区等地域分布特点[2]。HDCP易引发早产、胎盘早剥、产后出血、新生儿窒息等多种不良妊娠结局和溶血、肝肾功能不全等危急重症[3]，是孕产妇和胎儿死亡的重要原因之一[4]。HDCP中妊娠期高血压及子痫前期-子痫是妊娠期特发的产科并发症。该病的发病机制尚未完全阐明，目前大部分研究认为涉及胎盘缺血缺氧、子宫螺旋小动脉重铸不足、炎症免疫过度激活和氧化应激反应、血管内皮细胞受损、遗传因素，营养缺乏等多种因素和多种机制[2,5]，难以实施精准化防治。

microRNAs(miRNAs)是由长度约18～24个核苷酸的内源性非编码RNA组成，广泛参与调控细胞的生长、分化、增殖、凋亡等生理和病理生理过程[6]。目前研究发现,miR-301b-3p可促进细胞增殖、分化及侵袭，与多种恶性肿瘤的发生密切相关[7-11]。HDCP尤其是PE发生的病理基础是滋养细胞的侵袭不足，导致胎盘浅着床，出现相应的临床表型。先前多项研究发现多个miRNA，包括miR-15/16及miR-424等在胚胎滋养层细胞着床过程中发挥重要作用。还有研究发现，miR-301b-3p与血管收缩、高血压相关[12]，推测miR-301b-3p可能与HDCP有关。甘孜州海拔平均3500米，大部分孕妇处于高凝状态及轻度缺氧，发生心血管疾病的风险远高于平原地区孕妇。本研究通过检测miR-301b-3p在高原地区正常孕妇及HDCP患者间的表达，探讨miR-301b-3p是否与HDCP发生有关。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2019年1月至12月在甘孜藏族自治州人民医院住院治疗的单胎妊娠且尚未分娩发动的25例妊娠期高血压(pregnancy induced hypertension，PIH)患者、40例PE患者，并以同期住院单胎妊娠且尚未分娩发动的40例藏族正常晚期妊娠孕妇为正常对照。HDCP各亚型诊断标准参考妊娠期高血压疾病诊治指南(2020)[4]。排除标准：多胎妊娠，合并存在糖尿病、自身免疫性疾病、慢性肾脏病、感染或传染性疾病、甲状腺疾病、肿瘤、血液系统疾病，前置胎盘、胎盘早剥等产科并发症。记录研究对象的年龄、居住地区、体重、体质量指数(body mass index，BMI)、孕龄、月经史、孕产史、家族史、血常规、尿蛋白、肾功能、血脂分析等临床信息。研究对象均为甘孜籍藏族人群，常年居住于甘孜地区。

1.2 标本采集 抽取空腹肘静脉血10mL，于EDTA-K2抗凝管中静置30min，4℃、3000r/min离心10min，提取上清至EP管，4℃、16000g/min离心10min，将上清提取至EP管并保存于-80℃待检。

1.3 血浆总RNA提取 采用TaqMan miRNA ABC分离纯化试剂盒(Thermo Fisher Scientific，美国)提取血浆miRNA，紫外分光光度计测定吸光度(absorbance，A)260nm和A280nm的比值，将A260nm/A280nm在1.8～2.1的样本用于miR-301b-3p检测。

1.4 实时荧光定量PCR法检测miR-301b-3p及内参U6表达 qRT-PCR检测试剂盒(GeneCopoeia公司，广州)检测miR-301b-3p表达，具体操作参考试剂盒说明书。以U6为内参，采用2-△△CT方法计算目的基因相对表达量。

2 结 果

2.1 PE组、PIH组和正常妊娠组的基本临床资料比较 3组间年龄、孕周、白细胞、血红蛋白比较，差异无统计学意义(P>0.05)；3组间SBP、DBP、24h尿蛋白、D-二聚体、纤维蛋白原(Fib)、Scr等相比，差异有统计学意义(P<0.05)；SBP、24h尿蛋白、D-二聚体水平从正常妊娠组、PIH组至PE组呈现依次升高趋势(P<0.05)；PE组和PIH组的DBP、SCr、Fib等水平高于正常妊娠组(P<0.05)，PE组PLT水平低于正常妊娠组。见表1。

2.2 PE组、PIH组和正常妊娠组的血浆miR-301b-3p表达差异 实时荧光定量PCR法检测结果显示,PE组患者血浆miR-301b-3p表达显著低于正常妊娠组和PIH组(P<0.01)，妊娠期高血压组与正常对照组间差异无统计学意义。ROC曲线结果表明，miR-301b-3p对于排除PE具有较好的诊断价值(P<0.001)，AUC=0.860，约登指数最大为0.578，敏感度和特异度分别为95.0%和70.8%,见图1。

图1 子痫前期组、PIH组和正常妊娠组血浆miR-301b-3p表达和ROC曲线

2.3 发作与未发作PE患者血浆miR-301b-3p表达 40例PE患者中，9例患者子痫发作(eclamptic seizures，ES)。发作子痫患者的miR-301-3p表达明显低于未发作者(non eclamptic seizures，Non-ES)患者，差异有统计学意义(P<0.001)(图2)。

图2 子痫发作与未发作的PE患者血浆miR-301b-3p的表达变化

2.4 miR-301-3p表达与临床指标相关性 miR-301-3p表达与SBP、DBP、24h尿蛋白评分呈负相关(r=-0.721,r=-0.672,r=-0.871,P<0.001)，与D-二聚体水平呈负相关(r=-0.308,P=0.018)。

3 讨 论

随着医疗技术的进步和居民健康意识的提高，HDCP的发病率在平原地区得到了显著改善，但在高原地区仍居高不下[2]。由于高海拔地区氧气稀薄、气候寒冷、膳食结构以高动物脂肪和高热量的食物为主，导致了高原人血液具有“浓、黏、聚、凝”的特点。高原地区孕妇血液黏度明显增高，心脑血管疾病发生风险大为增加。甘孜州孕妇有多产习俗，且经济卫生条件落后，文化程度低，健康意识薄弱等[2,13-14]，导致严重妊娠并发症的风险大大增加。本研究纳入的是居住在海拔4000米以上的藏区孕妇，其HDCP发生率明显高于平原地区，且病情更为严重，因此找到可预测疾病发生或严重程度的标记物意义重大。

最近研究通过miRNA芯片技术检测发现，miRNA-301b是PE患者血浆中显著下调表达的miRNA之一[15]，但是其对PE的具体影响尚无研究。本研究发现，高原藏族PE患者血浆中miR-301b-3p表达显著低于正常妊娠组和PIH组，与上述研究结果一致，表明血浆miR-301b-3p的分布不受人群民族、高原地域的影响；HDCP组与正常组相比，血浆miR-301b-3p分布呈下降趋势，但差异无统计学意义，这可能与HDCP组样本量较少有关。本研究结果显示，发生ES的PE患者血浆miR-301b-3p水平显著低于Non-ES的PE患者，提示血浆miR-301b-3p表达水平与PE患者是否发生ES密切相关。表明血浆中低miR-301b-3p水平与PE的发生有关。本研究相关性分析显示，PE患者血浆miR-301-3p表达与SBP、DBP、24h尿蛋白评分呈显著负相关(P<0.001)，与D-二聚体呈负相关(P=0.018)。提示血浆miR-301-3p表达可作为PE患者严重程度的潜在标志。

本研究中ROC曲线结果提示，miR-301b-3p在PE的诊断和预测价值中的敏感度和特异性分别为95.0%和70.8%。推测miR-301b-3p可能是PE的一个预测因子。这有待进一步扩大样本量做队列研究，验证PE患者发病之前是否已出现miR-301b-3p表达异常降低。

研究发现，缺氧相关miR-301b可能通过调节靶基因的表达在细胞增长、减少凋亡、调节血管生成、促进细胞侵袭和转移中起重要作用。滋养细胞的浸润重塑螺旋小动脉的过程与肿瘤细胞的迁移、侵袭过程非常相似，因此缺氧反应性miR-301b可能参与了HDCP的发生发展。另有研究提出，细菌感染时miR-301b作为炎症平衡因子参与炎症应答，或miR-301b可能通过介导炎症介质异常分泌导致HDCP的发生[16]。

综上所述，血浆miR-301-3p表达与PE的发生及病情进展有关。但本研究还存在局限，如样本量相对少，仍需扩大样本量对本研究结果进行验证；现有关于miR-301b-3p的研究主要集中于肿瘤领域，对miR-301b-3p参与调控PE的机制尚不清楚，有待进一步探讨。