不同成熟度和产地初加工方法对栀子中4 种活性成分含量的影响

罗静玲，张湘龙，曾建国，谢红旗，陆 英,,

（1.湖南农业大学园艺学院，湖南长沙 410128；2.国家中药材生产（湖南）技术中心，湖南长沙 410128）

栀子（Gardenia jasminoidesEllis）又称黄栀子和山栀子，主产于湖南、湖北、四川等地，具有利湿除烦、凉血解毒[1]的功效，常用于清热泻火药中[2]。栀子具有丰富的药理活性成分，对人体有良好的营养保健作用[3]，是首批被纳入药食同源的中药之一。国内外众多学者对栀子的化学成分进行了深入研究，从栀子属植物中提取分离的活性化合物有40 多种，主要有栀子酸[4]、绿原酸[5]、栀子苷[6−8]和西红花苷Ⅰ[9−10]等。研究表明，栀子苷有保肝利胆[11]、镇痛消炎作用；栀子酸具有调节血压[12−13]的功效；绿原酸具有较为广泛的抗菌[14]、抗病毒、兴奋神经和清除人体内自由基[15]的作用；西红花苷Ⅰ具有凉血解毒[16]、抗癌[17−18]、抗氧化[19]的作用。

栀子采收后需及时处理，否则容易发霉，2020 版《中国药典》处理方式为：“9～11 月果实成熟呈红黄色时采收，蒸至上气或置沸水中略烫，除去果梗和杂质，取出，干燥”，其质量指标为“栀子苷不得低于1.8%”[2]；由此可见，药典中未明确蒸、煮时间及干燥方法，同时只有一个指标成分的含量要求。为了进一步探讨栀子的加工方法，刘涛等[20]以栀子苷及指纹图谱相似度为指标，对不同采收时间及产地加工方法的样品进行测定和比较，认为栀子颜色为青黄色时采收的栀子苷含量较高，将药材水煮后晒干较优；梁献葵等[21]通过测定栀子苷、西红花苷Ⅰ及总环烯醚萜苷的含量，确定栀子产地加工最佳蒸制时间为13 min、加明矾水煮8 min。潘媛等[22]以栀子苷、绿原酸和西红花苷Ⅰ以及抗氧化活性为指标，认为杀青以沸水煮9 min为宜；从文献可知，这些研究对栀子采收及产地初加工有一定的探讨，但缺乏系统性比较，对不同成熟度果实、不同干燥方法特别是常温储存一年后成分的变化少有研究。本研究针对文献的不足，以栀子中4 种主要成分绿原酸、栀子苷、栀子酸和西红花苷Ⅰ为指标，较系统的从上述几个方面进行相关研究，旨在为栀子的采收、产地初加工和储存提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜栀子 采自湖南耒阳富农农业开发有限公司栀子生产基地，于2019 年10 月22 日采收；绿原酸（≥98%）标准品，购自国药集团化学试剂有限公司；栀子苷（≥98%）标准品，中山市成诺生物科技有限公司；栀子酸（≥98%）标准品，北京精纯化工技术研究院；西红花苷Ⅰ（≥98%）标准品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

AUW220D电子天平 日本岛津公司；HPLC：配有SPD-M20A 230V检测器，色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm，4.6 mm×250 mm），LC-20AT高压泵，SIL-20A自动进样器 日本岛津公司；KM5200DE超声波清洗器（功率200 W）昆山美美超声仪器有限公司；WGL-230B电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 高效液相色谱法（HPLC）测定栀子中4 种活性成分

1.2.1.1 HPLC分析方法 流动相A：0.1%磷酸水，流动相B：乙腈；0→25 min:5%→18% B；25→30 min:18%→32% B；30→40 min:32%→32% B；流速1.0 mL/min，柱温箱恒温35℃[23]，进样量20 μL；检测波长：栀子酸和栀子苷238 nm[24−25]，绿原酸328 nm[26]，西红花苷Ⅰ 440 nm[27]。

1.2.1.2 标准曲线绘制方法 精确称取栀子酸1.40 mg、绿原酸0.94 mg、栀子苷1.04 mg、西红花苷Ⅰ 0.99 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，配制成终浓度为0.137、0.092、0.102、0.097 mg/mL的储备液，临用前用甲醇稀释至一定浓度梯度，在1.2.1.1 条件下进样，记录峰面积,以进样质量（mg）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.1.3 样品含量测定方法 称取栀子干燥粉末0.10 g，加入40 mL质量浓度为40%的甲醇，称定锥形瓶总质量，置于30 ℃超声提取40 min，提取完毕后用提取液补充至超声前锥形瓶总质量，摇匀后取溶液过0.45 μm有机滤膜，进样20 μL。根据标准曲线计算样品含量，根据含水量[28]换算成干品含量。

1.2.2 栀子中4 种活性成分提取条件的确定

1.2.2.1 甲醇体积分数对提取效果的影响 称取0.10 g干燥栀子粉末6 份，分别加入50 mL体积分数为0、20%、40%、60%、80%、100%的甲醇溶液，称定锥形瓶总质量，超声提取30 min，提取完毕后用提取液补充至超声前锥形瓶总质量，摇匀后取溶液过0.45 μm有机滤膜，按1.2.1.1 方法进行HPLC测定。

1.2.2.2 料液比对提取效果的影响 称取0.10g干燥栀子粉末5 份，分别按料液比1:200、1:300、1:400、1:500 加入所需甲醇体积（甲醇体积分数为前一步实验确定的最佳甲醇体积分数），称定锥形瓶总质量，超声提取30 min，提取完毕后用提取液补充至超声前锥形瓶总质量，摇匀后取溶液过0.45 μm有机滤膜，按1.2.1.1 方法进行HPLC测定。

1.2.2.3 提取时间对提取效果的影响 称取0.10 g干燥栀子粉末6 份，按最佳甲醇体积分数、最佳料液比加入所需甲醇体积，称定锥形瓶总质量，分别超声提取10、20、30、40、50、60 min，提取完毕后用提取液补充至超声前锥形瓶总质量，摇匀后取溶液过0.45 μm有机滤膜，按1.2.1.1 方法进行HPLC测定。

1.2.3 栀子产地初加工处理方法 选择中成熟度鲜果分成若干份（每份50 个果）后进行下列不同处理。

1.2.3.1 杀青方法对栀子4 种活性成分的影响 蒸法杀青[29]：预实验表明，栀子在蒸汽杀青30 s就能达到透心的效果，因此实验设置最低时间为30 s。取4 份鲜果，置沸水中隔水分别蒸30、60、90、120 s后取出，沥干水分，置60℃烘箱中烘干[30]。

煮法杀青[29]：预实验表明，栀子在煮法杀青10 s就能达到透心的效果，因此实验设置最低时间为10 s。取5 份鲜果，置沸水中分别煮10、20、30、40、50 s后取出，沥干水分，置60℃烘箱中烘干。

不杀青：取1 份鲜果，置60 ℃烘箱中烘干。

1.2.3.2 不同干燥方法的比较 取7 份鲜果，置沸水中煮10 s后取出，沥干水分后分别采用晒干、阴干、40、50、60、70、80 ℃烘箱烘干。

1.2.3.3 切制与不切制的比较 取2 份鲜果，置沸水上蒸120 s后取出，其中一份纵向切成两半，另一份不切，两份同置60 ℃烘箱中烘干。

1.2.4 不同成熟度栀子中活性成分含量比较 根据栀子果皮色泽分成4 种不同成熟度（青果、轻成熟果、中成熟果、成熟果），各取1 份置沸水上蒸120 s后取出，同置60 ℃烘箱中烘干。

1.2.5 储存对栀子中活性成分的影响 将干燥样品室温避光储存一年、一年半后测定各成分含量。

1.3 数据处理

采用IBM SPSS Statistics 26.0 分析栀子中4 种活性成分含量的差异。

2 结果与分析

2.1 栀子中4 种活性成分的HPLC分析

经标准品扫描发现，栀子酸和栀子苷最大吸收波长为238 nm，绿原酸为328 nm，西红花苷Ⅰ为440 nm，因此采用三个波长分别测定该4 种成分。通过洗脱程序调整，在1.2.1.1 色谱条件下目标组分能得到很好分离。不同波长下的栀子甲醇提取液见图1。

图1 不同波长下标准品及栀子提取物的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of standards and Gardenia extracts at different wavelengths

2.2 标准曲线的绘制

以化合物质量（mg）为横坐标（x）,峰面积为纵坐标（y）绘制栀子中4 种活性成分的标准曲线，结果见表1。由表可知，表中化合物的质量与峰面积呈良好的线性关系，可以用于含量测定。

表1 4 种标准品的回归方程、线性范围和最低检出限Table 1 Regresssion equation,linear range and minimum detection limit of four standard substances

2.3 栀子中4 种活性成分同时提取条件确定

2.3.1 甲醇体积分数的确定 由表2 可见，随着甲醇浓度的升高，栀子中四种活性成分的含量多呈现先升高后降低的趋势，其中40%～60%甲醇提取绿原酸、栀子苷、西红花苷Ⅰ没有显著性差异(P>0.05)，栀子酸使用40%甲醇提取效果更佳，因此选择40%甲醇提为提取溶剂。

表2 不同溶剂对栀子中活性成分含量的影响Table 2 Effect of different solvents on the content of active component in Gardenia

2.3.2 料液比的确定 由表3 可见，在实验浓度范围内，随着料液比的增加，栀子中4 种活性成分溶出增大，在使用400 倍溶剂用量后趋于平稳，因此选择料液比为1:400（g/mL）。

表3 料液比对栀子中活性成分提取的影响Table 3 Effect of material-to-liquid ratio on extraction of active component in Gardenia

2.3.3 提取时间的确定 由表4 可见，提取时间为10～30 min内提取量低，栀子中4 中活性成分提取不充分，提取时间为40～60 min内提取量趋于稳定，因此选择提取时间为40 min。

表4 提取时间对栀子中活性成分含量的影响Table 4 Effect of extraction time on the content of active component in Gardenia

2.4 产地初加工方法对栀子4 种活性成分的影响

2.4.1 蒸法杀青时间对活性成分的影响 由表5 可知，蒸杀青处理90 s和120 s的4 种活性成分含量之间的差异无统计学意义(P>0.05)；杀青时间越短越有利于栀子酸的保留，对于绿原酸、栀子苷和西红花苷Ⅰ来说，则需要较长的杀青时间。总体来说，蒸法杀青时间以120 s最佳。

表5 蒸法杀青时间对栀子中活性成分含量的影响Table 5 Effect of steaming fixation time on the content of active component in Gardenia

2.4.2 煮法杀青对4 种活性成分的影响 由表6 可知，在杀青时间30～40 s内4 种活性成分含量相近，除栀子酸和绿原酸含量有所降低外，栀子苷和西红花苷Ⅰ含量较高。综合考虑，煮法杀青时间以30 s最佳。

表6 煮法杀青不同时间栀子中活性成分含量Table 6 Effect of boiling fixation time on the content of active component in Gardenia

2.4.3 不同杀青方法对栀子中4 种活性成分含量的影响 由表7 可知，杀青与不杀青对栀子苷和栀子酸无显著影响(P>0.05)，但杀青样中绿原酸和西红花苷Ⅰ显著高于不杀青样（P<0.05）；两种最佳杀青时间处理样品4 种成分均无显著差异(P>0.05)。同时，不杀青样品干燥后放置一段时间后易长霉，因此，栀子干燥前进行杀青处理很有必要。

表7 杀青方式对栀子中活性成分含量的影响Table 7 Effect of fixation methods on the content of active component in Gardenia

2.4.4 不同干燥方法对栀子中4 种活性成分含量的影响 由表8 可知，热风烘干时，随着烘干温度的升高，栀子酸、西红花苷Ⅰ有下降趋势，40 ℃最高，50～80 ℃下降但无显著差异(P>0.05)；绿原酸、栀子苷先升后降然后趋于平稳，50 ℃含量最高；阴干和晒干样中栀子苷、栀子酸显著低于烘干(P<0.05)，西红花苷Ⅰ低于40 ℃烘干但高于其他温度；综合考虑，干燥以50 ℃烘干最佳。同时，晒干、阴干样中栀子苷也高于《中国药典》标准的1.8%[2]，但阴干样品在干燥过程中就部分发生霉变，因此，采用晒干方式也是可行的。

表8 不同干燥方法对栀子中活性成分含量的影响Table 8 Effects of different drying methods on the content of active components in Gardenia

2.4.5 切制对栀子中4 种活性成分含量的影响 由表9 可知，切制后干燥的样品中栀子苷、西红花苷Ⅰ含量显著高于不切制干燥样（P<0.05）。在试验过程中发现，切制后烘干12 h即可达到干燥效果，不切制需要烘干36 h才达到干燥效果，切制后干燥减少了干燥过程中化合物含量的变化。因此，可以根据加工后储存时间及条件采取切制加工干燥。

表9 切制对栀子中活性成分含量的影响Table 9 Effect of cutting on the content of active ingredients in Gardenia

2.5 不同成熟度栀子中4 种活性成分含量

由表10 可知，4 种成熟度果中的栀子苷均高于《中国药典》要求的1.8%[2]，轻成熟果、中成熟果、成熟果中无统计学差异（P>0.05），以中成熟果最高，三者显著高于青果（P<0.05）；栀子酸和西红花苷Ⅰ随果实成熟含量显著增加（P<0.05），在成熟果中含量最高；绿原酸和栀子苷随果实成熟有先升后降的趋势，在轻成熟果中含量最高；因此，综合来说，栀子采收以中成熟和成熟时采收最佳。

表10 不同成熟度栀子及其活性成分的含量Table 10 Different maturity and active ingredients in Gardenia

2.6 储存时间对栀子4 种活性成分含量的影响

加工后的栀子果实储存室温避光储存一年后4 种化合物含量差异见表11，不管是煮法杀青还是蒸法杀青、切制还是不切制，栀子酸、绿原酸和西红花苷Ⅰ储存一年和一年半后含量较加工完成时没有显著变化（P>0.05），而栀子苷含量显著降低（P<0.05），但仍高于中国药典标准规定的1.8%[2]。

表11 储存时间对栀子中活性成分含量的影响Table 11 The effect of storage time on the content of active ingredients in Gardenia

3 结论

本研究优化了栀子中4 种活性成分同时提取的条件和不同产地初加工方式对它们含量的影响。结果表明，栀子应以中成熟和成熟时采收；采用400 倍40%的甲醇超声提取40 min效果较好；加工方式以切制烘干（50 ℃）并杀青处理最佳，蒸法和煮法两种杀青效果对栀子中4 种活性成分含量无显著影响（P>0.05）。虽然不杀青处理也能达到药典指标栀子苷含量不得低于1.8%[2]，但实践中不易干燥和保存，且易长霉，因此进行杀青处理很有必要。

经过室温避光储存一到一年半后，蒸法杀青和煮法杀青的栀子中栀子酸、绿原酸、西红花苷Ⅰ的含量有所下降，但没有显著差异；栀子苷含量显著降低（P<0.05），因此，不建议对栀子进行长期储存。