樟叶木脂素的提取纯化及其抗氧化性、抗癌活性

周海旭，苏同超，李 姝，冉军舰，李 波，高 晗，余梦薇，薛静丽，李婧瑜，李晓晴，李忠海,2,

（1.河南科技学院食品学院，河南新乡 453003；2.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南长沙 410004）

樟树主要生长于中国长江以南地区，因其可作为中药而具有极高的开发价值[1]。樟树叶含有多种天然活性成分，例如多酚[2]、黄酮[3]、生物碱[4]、木脂素[4−5]等。其中木脂素是由两分子C6C3组成的苯丙素及其衍生物组成[6]。目前已从樟树叶中提取得到的木脂素有芝麻素、（+）-diasesamin[3]，新芝麻脂素[4]，maculation[5]等。研究表明木脂素具有抗氧化[7]、抗癌[8]、抑菌[9]、抗病毒[10]、保护肝脏[11−12]、抗炎[13−14]等功效。在实际生活中，樟叶凋落后经常被当成垃圾丢弃或进行焚烧处理，这不仅造成资源的浪费，而且还造成环境的污染。

现有的文献表明木脂素的提取方法主要有加热回流法[15]、微波提取技术[1]、超声波提取技术[6]、超临界提取技术[16]等。超声波提取法利用其空穴效应、热效应和机械作用来提高天然产物得率[17]，具有耗时短、操作简单的优点[18]。与本团队已研究的微波法[1]相比，超声波技术具有高效、便捷的优势。响应面分析技术采用多元二次回归方程来拟合影响因素与响应值之间的关系，是有效优化工艺条件的方法，可精确表述各个因素与响应值之间的关系[19−20]。

因此本研究拟用超声波提取法辅助提取樟树叶中的木脂素，并利用响应面法优化提取工艺以获得樟叶木脂素的最优值。在此基础上，通过HPLC分析纯化后樟树叶木脂素的纯度；同时利用对DPPH自由基、羟基自由基的清除效果研究樟树叶木脂素的抗氧化活性；以肝癌细胞（HepG2）、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）为研究对象分析樟叶木脂素的细胞毒性作用，以期将樟叶变废为宝，为樟叶木脂素应用于食品行业提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

樟叶 采自校园内小叶樟叶树种；五味子酯甲标准样品 纯度≥98%，上海金穗生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）合肥博美生物公司；芝麻素标准品、松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷标准品纯度≥98%，Sigma公司；肝癌细胞（HepG2 cells ATCC HB-8065）、人脐静脉内皮细胞（HUVEC cells ATCC CRL-1730）索莱宝生物科技有限公司；胎牛血清（FBS）BI公司；1640 培养基、双抗（antianti）、0.25%胰酶（1×）Gibco公司；MTS试剂盒美国贝博生物；其他试剂 均为分析纯。

SHB-Ⅲ循环水式旋转蒸发仪 郑州长城科工贸有限公司；JY92-11 超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；UV3700 紫外可见分光光度仪 日本岛津公司；S111CO2培养箱 Thermo公司；TC20 细胞计数仪 BIO-RAD公司；DW-HL388−80℃超低温冰箱 中科美菱低温科技有限责任公司；RT-6000 酶标仪 深圳雷杜生命科学股份有限公司；ICX41 倒置显微镜 舜宇光学科技（集团）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程 樟树叶→风干→粉碎→超声波辅助提取（3 次）→常温下浸提提取（25 ℃，2 h）→离心（4000 r/min,15 min）→浓缩→冷冻干燥（−40 ℃，48 h）→粗木脂素

1.2.2 单因素实验设计 以料液比、超声时间、乙醇浓度、浸提时间为因素，考察各因素对木脂素提取量的影响。

1.2.2.1 料液比对樟树叶木脂素提取量的影响 以超声波功率300 W，超声时间20 min，乙醇浓度60%，浸提时间60 min为固定条件，考察液料比（g/mL）分别为1:5、1:10、1:15、1:20、1:25 对樟叶木脂素提取量的影响。

1.2.2.2 超声时间对樟树叶木脂素提取量的影响以超声波功率300 W，1.2.3.1 中最优料液比，乙醇浓度60%，浸提时间60 min为固定条件考察超声时间为2、3、4、5、6 min时对樟树叶中木脂素提取量的影响。

1.2.2.3 乙醇浓度对樟树叶木脂素提取量的影响以超声波功率300 W，1.2.3.1 中最优料液比，1.2.3.2中最优超声时间，浸提时间60 min为固定条件，考察乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%、100%时对樟树叶中木脂素提取量的影响。

1.2.2.4 浸提时间对樟树叶木脂素提取量的影响以超声波功率300 W，1.2.3.1 中最优料液比，1.2.3.2中最优超声时间，1.2.3.3 中最优乙醇浓度为固定条件，分别考察浸提时间为40、60、80、100、120 min时对樟树叶中木脂素提取量的影响。

1.2.3 响应面试验设计 根据单因素实验结果，以木脂素提取量为指标，采用Box-Behnken设计原理进行响应面试验设计，优化超声波提取技术提取樟树叶木脂素工艺条件，响应面试验中各因素及水平见表1。

表1 Box-Behnken试验因素与水平设计Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

1.2.4 木脂素提取量的测定 标准曲线制定：按照周海旭等[1]的测定方法进行测定。最终得到标准曲线为Y=0.0088X+0.1328，R2=0.9992，其中：X为标准液的浓度（mg/L），Y为吸光度值。

样品测定：称取樟树叶粉末1.0 g，置于50 mL的烧杯中，加入95%乙醇溶液20 mL，超声辅助提取5 min（300 W），冷却至室温，常温下浸提2 h，真空过滤后离心10 min，取上清液备用[21]。根据标准曲线制定方法测定样品中木脂素的浓度，并参照李应洪等[22]的计算方法进行木脂素提取量的计算。计算公式如式（1）所示:

其中：y—樟树叶中木脂素提取量，mg/g；c—樟树叶中木脂素浓度，mg/L；v—样品体积，L；m—樟树叶粉末质量，g。

1.2.5 木脂素的纯化及纯度的计算 按照响应面实验所得到的最优组合进行多次提取，收集提取液进行浓缩后得到深绿色的膏状物质。按照本团队前期研究的方法[21]进行萃取、分离、纯化，高效液相法进行纯度鉴定。纯度计算公式如式（2）所示：

1.2.6 樟叶木脂素的抗氧化活性研究

1.2.6.1 清除DPPH自由基的能力 参考Lu等[23]的方法并进行稍微修改。将处理好的样品用无水乙醇溶解，VC溶液作为阳性对照。向DPPH乙醇溶液（3.5 mL，30 mg/L）中分别加入浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的提取液0.5 mL，于517 nm处测定吸光值（X1）；向3.5 mL无水乙醇溶液中分别加入0.5 mL相同浓度的样品溶液并测定吸光度（X2）；向DPPH乙醇溶液（3.5 mL，30 mg/L）中加入0.5 mL无水乙醇溶液并测定其吸光值（X0），此为空白组。

通过式（3）计算DPPH·清除率：

其中：X1—样品在DPPH溶液中的吸光值；X2—样品在无水乙醇溶液中的吸光值；X0—空白组吸光值。

1.2.6.2 清除·OH的能力 参考牛广财等[24]的方法并进行稍微修改。向1 mL浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的样品溶液中依次加入5 mmol/L邻二氮菲0.6 mL，pH7.4 磷酸盐缓冲液0.4 mL，0.01 mol/L FeSO4溶液0.3 mL，0.02 mol/LEDTA溶 液0.3 mL，蒸馏水0.6 mL，0.1%H2O20.8 mL于37 ℃下反应1 h，冷却后于511 nm处测定吸光值A1（样品）。同样操作不加入样品液和H2O2测定吸光值A2（未损伤）；同样操作不加入样品液测定损伤吸光度值A0（损伤）通过以下公式计算清除率。VC溶液作为阳性对照。通过式（4）计算·OH清除率：

1.2.7 MTS法测定木脂素的细胞毒性作用 利用MTS法检测纯化后樟叶木脂素对肝癌细胞HepG2和人脐静脉内皮细胞HUVEC毒性作用。参照Ma等[25]方法进行测定。HepG2 和HUVEC细胞经过活化培养后，调整其细胞浓度分别为9×104、6×104个/mL。分别取100 μL于96 孔板中并于37 ℃下培养5 h。吸走旧培基，将含有不同终浓度样品溶液的培养基（0、50、100、200、300、400 μg/mL）加入到96 孔板中并进行培养。显微镜下观察经样品处理后HepG2 和HUVEC细胞的状态以确定培养时间。每个浓度重复3 次。培养完全后，避光下向各孔中加入 10 μL的MTS溶液并培养2 h。之后在490 nm处测定各孔的吸光度（OD值）。

细胞生长存活率的计算方法如式（5）所示：

1.3 数据处理

每个实验重复三次。实验数据以Excel进行统计分析，并通过Origin 8.0 作图；响应面试验通过Design expert 8.0.5 进行实验设计和数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 料液比对樟叶木脂素提取量的影响 樟叶木脂素提取过程中主要受到扩散作用的影响，溶剂的量越大，则扩散速率越大[26]。由图1 可知，料液比在1:5～1:20 g/mL范围内，木脂素提取量随着料液比的变化，木脂素提取量由6.89 mg/g增加到23.67 mg/g，当达到1:20 g/mL，木脂素提取量达到最大值，继续改变料液比值，木脂素提取量降低，因此确定最适料液比为1:20 g/mL。

图1 料液比对木脂素提取量的影响Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on the yield of lignans

2.1.2 超声时间对樟叶木脂素提取量的影响 从图2可以看出，当超声时间2～3 min时，木脂素提取量不断增加，由27.69 mg/g增加到34.39 mg/g；当超声时间超过3 min，木脂素提取量增加的幅度比较缓慢。这是因为超声波破坏樟树叶细胞，可以促进木脂素的提取。但当超声时间大于3 min，木脂素提取量增加平缓。超声时间太久，整个系统的温度会逐渐升高，并且超声时间延长会使部分木脂素被超声剪切力降解或者高频运动产热降解，这将不利于木脂素的提取[27]。因此确定最适超声时间为3 min。

图2 超声时间对木脂素提取量的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on the yield of lignans

2.1.3 乙醇浓度对樟叶木脂素提取量的影响 木脂素类物质属于中等极性物质，根据相似相溶的原理，提取液浓度的极性不能太小。从图3 中可以看出，当乙醇由50%到60%时，木脂素提取量由19.82 mg/g增加到31.54 mg/g。当乙醇浓度大于60%以后，木脂素提取量有所降低。因此确定最适乙醇浓度为60%。

图3 乙醇浓度对木脂素提取量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield of lignans

2.1.4 浸提时间对樟叶木脂素提取量的影响 从图4中可以看出，在40～80 min内，随着提取时间的增加，木脂素提取量由31.63 mg/g增加到37.94 mg/g；当提取时间超过80 min，随着提取时间的增加，木脂素提取量呈降低趋势，这可能是因为提取时间过长导致木脂素在空气中暴露时间长，部分木脂素被氧化[28]，所以确定最适提取时间为80 min最合适。

图4 提取时间对木脂素提取量的影响Fig.4 Effect of extraction time on the yield of lignans

2.2 响应面法优化分析

2.2.1 响应面试验结果 根据单因素实验结果，以考察的单因素为自变量，以木脂素提取量为响应值，利用响应面试验进行分析，试验设计及结果见表2。

2.2.2 响应面回归模型的建立 通过响应面相关软件对表2 中的提取量进行拟合回归，得到以下方程：

表2 Box-Benhnken试验设方案及结果Table 2 The program and result of Box-Benhnken experiment design

Y=44.48+1.52A−1.02B+0.036C−1.60D+1.37AB−0.87AC−3.18AD+1.05BC−0.73BD−2.30CD−2.97A2−4.94B2−5.01C2−3.26 D2

2.2.3 响应曲面分析 表3 中回归模型的P<0.0001，表明该模型极为显著，失拟项（P>0.05）不显著，表明方程可以很好地分析数据[1]。因此可以利用该数学模型计算粗樟叶木脂素提取量[29]。R2=0.9861，说明木脂素提取量的变化中有98.61%来自于所选试验因素，因此该回归方程可以很好地描述各试验因素与提取量之间的变化关系R2adj=0.9653，说明该模型能解释96.53%响应值的变化[30]。

由表3 可知，回归方程中一次项A、B、D，二次项影响因素的P值均小于0.01，说明其对木脂素提取量的影响极为显著；交互项因素影响P值均小于0.01，说明各个因素对木脂素提取量均具有极显著性的影响且它们之间并非简单的线性关系。F值表示各个变量对木脂素提取量的影响程度，F值越大，表明该因素的影响程度越大[31]。由表3 中F值大小可知，浸提时间对樟叶木脂素提取量的影响程度最大，乙醇浓度对樟叶木脂素提取量的影响程度最小。由图5 可知，因素之间交互作用对木脂素提取量呈现的曲面图均比较陡峭，说明了它们对木脂素提取量影响均比较显著。

图5 料液比、超声时间、乙醇浓度、浸提时间相互作用对樟叶木脂素提取量影响的曲面图Fig.5 Response surface of the effect of the liquid-to-solid ratio,ultrasonic time,ethanol concentration,extraction time on the yield of lignans

表3 木脂素提取量的方差分析结果Table 3 ANOVA analysis of the yield of lignans

对回归方程中的自变量求一阶偏导从而得到四组二元一次方程[32]。对此方程组求解，得到A，B，C，D的 值分别为1:22.35 g/mL，3.09 min，63%，78.4 min，在此条件下木脂素提取量45.39 mg/g。为了方便实验的进行各个变量最终取值为料液比1:22 g/mL，超声时间3 min，乙醇浓度60%，提取时间78 min。

利用所选取的最优条件来验证实验模型的可靠性。在最优条件下进行5 次试验，木脂素提取量的平均值为45.31 mg/g，这与樟叶木脂素提取量理论值45.39 mg/g基本相同，相对误差为0.16%，证明了该模型可以用来预测樟树叶中木脂素的提取量。

2.3 樟叶木脂素纯度分析

粗木脂素经过AB-8 大孔树脂、硅胶柱色谱纯化。运用紫外色谱、红外光谱、质谱、核磁共振等方法进行结构鉴定[21]，最终得到松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷（图6）、芝麻素（图7）。

采用外标法对松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷的纯度进行判定。由图6A中可以看出在0.2～1.0 mg/mL范围内随着样品浓度的增加，峰值也逐渐增加。峰高与标准品之间存在线性关系，其线性回归方程：y=108.73x−0.124,R2=0.999，其中x表示标准品的浓度（mg/mL）。图6B表示样品中松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷峰高为82.9 mV。根据回归方程可得松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷纯度为90.14%。

图6 不同标准品浓度（A）和樟叶中松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷（B）的液相图Fig.6 HPLC chromatograms of different concentrations of standard sample (A) and the pinoresinol-β-D-glucoside from Cinnamomum camphora leaves (B)

由图7A中可以看出0.2～1.0 mg/mL浓度范围内随着标准样品浓度的增加，峰值也逐渐增加。内嵌图表明峰高与标准品存在线性关系，回归方程为y=90.70x+3.16，R2=0.996。图7B表示样品中芝麻素峰高为104.6 mV。根据回归方程可以求出芝麻素的纯度为94.84%。

图7 不同标准品浓度（A）和樟叶中芝麻素（B）的液相色谱图Fig.7 HPLC chromatograms of different concentrations of standard sample (A) and the sesamin from Cinnamomum camphora leaves (B)

2.4 樟叶木脂素的抗氧化性研究

2.4.1 清除DPPH自由基的作用 DPPH法是一种被国内外广泛应用于评价天然物质抗氧化效果的方法。DPPH清除自由基的原理是指在含氢天然抗氧化物质存在下，DPPH将被还原为DPPH-H，从而导致试剂的颜色发生褪色[33]。研究表明，多糖属于氢供体物质，可与自由基反应以生成更稳定的产物[34]。从图8 可知在浓度0.2～1.0 mg/mL范围内随着脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、芝麻素、VC浓度的增加，DPPH自由基清除率也在增加。由图可知，VC对DPPH自由基的清除效果优于木脂素，并且清除DPPH自由基的IC50小于0.2 mg/mL；松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷清除自由基的线性方程为y=51.84x+34.19，R2=0.906，经计算松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷清除DPPH自由基的IC50为0.31 mg/mL；芝麻素清除自由基的线性方程为y=50.84x+21.99，R2=0.994，经计算芝麻素清除DPPH自由基的IC50为0.55 mg/mL。由此可知樟叶木脂素具有良好的清除DPPH自由基能力；从IC50值可知清除DPPH自由基的能力为VC>松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷>芝麻素。

图8 芝麻素和松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷对DPPH自由基清除作用Fig.8 Effect of sesamin and pinoresinol-β-D -glucoside on DPPH free radical

2.4.2 清除羟基自由基的作用 由图9 可知，VC和木脂素物质对羟基自由基具有强烈的清除效果。VC清除羟基自由基的线性方程为y=95.45x−1.34，R2=0.966，经该方程计算VC的IC50为0.54 mg/mL；松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷清除羟基自由基的线性方程为y=86.31x−11.76，R2=0.984，经计算松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷清除羟基自由基的IC50为0.71 mg/mL；芝麻素清除自由基的线性方程为y=67.31x−12.96，R2=0.974，经计算芝麻素清除羟基自由基的IC50为0.94 mg/mL。根据IC50值的大小可以看出VC清除羟基自由基的能力最强，其次是松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷，最后是芝麻素。松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷与芝麻素清除羟基自由基的差异可能是因为两者分子结构存在差异。例如羟基数量越多，抗氧化性能越强；葡萄糖苷配基的数量多，抗氧化性能越强[35]。

图9 芝麻素和松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷对羟基自由基清除作用Fig.9 Effect of sesamin and pinoresinol-β-D -glucoside on ·OH radical

2.5 细胞毒性作用

采用MTS法检测松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、芝麻素对肝癌细胞和HUVEC细胞生长抑制作用，结果如图10、图11 所示。由图10 可知，随着松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、芝麻素浓度的不断增加，HepG2 细胞存活率逐渐减少。两者浓度在0～400 μg/mL范围内，芝麻素对肝癌细胞的生长抑制作用强于松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷。由图11 可知芝麻素对HUVEC的毒性作用大于松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷。因此，如果将芝麻素应用于食品当中，它不仅对肝癌细胞有作用还对人体的正常细胞HUVEC有毒性作用；而松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷对HUVEC毒性作用则相对小些。这主要跟芝麻素和松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷影响细胞周期及凋亡过程中的相关蛋白和基因的表达有关。杨永丹[36]研究芝麻素对肝癌细胞的影响，结果表明芝麻素可以影响细胞周期蛋白Cyclin A和Cyclin B的转录与表达，增强抑癌基因p53、p21 和促凋亡因子Bax的表达量。

图10 芝麻素与松脂素-β-D-葡萄糖苷对肝癌细胞HepG2 的影响Fig.10 Effect of sesamin and pinoresinol-β-D-glucoside on HepG2 cells

图11 芝麻素与松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷对人脐静脉内皮细胞HUVEC的影响Fig.11 Effect of sesamin and pinoresinol-β-D-glucoside on HUVEC cells

3 结论

本实验在单因素实验的基础上，根据响应面优化试验条件得到樟叶木脂素的超声辅助提取最优工艺条件：料液比1:22 g/mL、超声时间3 min、乙醇浓度60%、提取时间78 min条件下，木脂素提取量45.31 mg/g。经验证，实际值与预测值之间的相对误差仅为0.16%，表明了该模型具有较高实用性。粗提物经过分离纯化、结构鉴定后确定出两种木脂素类物质即芝麻素、松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷。利用高效液相色谱法确定芝麻素、松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷的纯度分别为94.84%和90.14%。对所得的木脂素进行抗氧化活性研究表明了芝麻素、松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷对DPPH自由基和羟基自由基有较好的清除效果，且清除效果随着浓度的增加而增加；MTS实验表明芝麻素、松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷均对HepG2、HUVEC有不同程度的抑制作用，其中芝麻素对肝癌细胞的毒性作用强于松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷，这可能与两者之间的结构有关系，需要进一步的研究。芝麻素、松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷对肝癌的毒性作用机理需要深入研究。