荧光定量PCR检测HBV-DNA与ELISA法乙肝免疫学检测的探讨

周晓莹，林珠，胡塔，邝炎波

（广东省妇幼保健院 检验科，广东 广州 510010）

0 引言

乙型肝炎病毒是流行最广，危害最严重的病毒性肝炎，在我国，HBV感染人群可达到60%以上，其中乙肝个体中10%可导致慢性携带状态，其中一部分会发展成慢性肝炎，需接受抗病毒治疗。临床表现为恶心、食欲减退、腹部不适和肝区疼痛等症状。有些患者还可出现黄疸发热和肝功能损害，若未进行有效的治疗和病情控制，可发展成肝硬化，甚或是肝癌[1]。因此，对乙肝病毒的检测和诊断就非常重要了。乙肝逐渐成为世界性慢性疾病，在乙肝患者的诊断中，实时荧光定量PCR可通过敏感反应HBV病毒水平，ELISA法能够对病型进行分型[2]。为了进一步探讨HBV-DNA和乙肝免疫学检测的关系，指导临床乙肝防治工作，现将乙型肝炎的两种检测结果进行分析，现报告如下。

1 资料及方法

1.1 一般资料。研究对象是我院2018年4月至2020年4月在我院检测的172份HBsAg反应性的血液样本，所有样本均行ELISA法乙肝免疫学指标检测和荧光定量PCR检测HBV-DNA。在这些标本所属的患者中，包括男性112例、女性60例，年龄：年龄18～66岁、平均（44.23±4.27）岁，所有患者的HBsAg均为阳性。根据化学发光酶联免疫检测方法（ECLIA）检验结果的阴阳性进行分组，大三阳组58例[HBsAg（+）HBcAb（+）HBeAg（+）]、小三阳组32例[HBsAg（+）HBcAb（+）HBeAb（+）]、A组38例[HBsAg（+）HBeAg（+）]、B组21例[HBsAg（+）HBeAg（-）]、C组23例[HBsAg（+）HBcAb（+）]。

1.2 方法。所有患者均接受ELISA法检测和实时定量PCR检测。ELISA法：仪器：采用深圳爱康公司生产的型号为AE280型的全自动酶免疫分析仪，检测试剂。一检试剂厦：门英科新创科技有限公司生产，弱阳性质控品浓度0.5 IU/mL；二检试剂：北京万泰生物药业有限公司，弱碱性质控品浓度0.2 IU/mL。所有患者的血清学检测均由上述两个不同厂家的试剂进行两次检测，两次均合格，此项结果合格，单试剂反应性时需进行双孔复试，任意一孔反应性则为不合格，不合格直接淘汰；双试剂反应性直接判定该项目不合格；不合格直接淘汰，不再行NAT检测，对合格样本行HBV-DNA检测。检测项目：乙肝表面抗原（HBSAg）、乙肝表面抗体（HBSAb）、e抗原（HBeAg）、e抗体（HBeAb）、核心抗体（HBcAb）荧光定量PCR法：仪器：科华核酸检测系统：Hamiltion Star+ABI 7500扩增仪。所用试剂均为伤害科华生物工程有限公司生产，质控品浓度HBVDNA200 IU/mL、HCV-RNA2000 IU/mL、HIVRNA2000 IU/mL，各项操作按照流程进行。

1.3 观察指标与评价标准。①大三阳组和小三阳组的HBV-DNA比较；②大三阳组和小三阳组的Ct值比较；③A/B/C组与HBV-DNA比较。采用定量法检测标准：HBsAg＞0.5 IU/mL为阳性、HBsAb＞1.0 IU/mL为阳性；采用标本相对光强度与临界相对光强度比值检测HBeAb、HBeAg、HBcAb，HBeAg＜1.0 S/co为阴性；HBeAb＞1.0 S/co为阴性；HBcAb＞1.0 S/co为阴性。

2 结果

2.1 大三阳组和小三阳组的HBV-DNA。大三阳的阳性检出率为93.10%，小三阳组的为56.25%，有显著统计学差异，P＜0.05，如表1所示。

表1 两组大三阳组和小三阳组的HBV-DNA阳性检出率对比表[n（%）]

2.2 大三阳组和小三阳组的Ct值比较。由检测结果得知，大三阳组的Ct值显著高于小三阳组，比较差异具备统计学意义（P＜0.05），如表2所示。

表2 大三阳组和小三阳组的Ct值对比表（±s）

表2 大三阳组和小三阳组的Ct值对比表（±s）

组别 例数 Ct值大三阳 58 37.02±0.04小三阳 32 32.15±0.26 t-105.272 P-0.000

2.3 A/B/C三组与HBV-DNA对比。由检测结果得知，A、B、C三组的阳性检测率和Ct值比较均有显著统计学意义，P＜0.05，如表3所示。

表3 A/B/C三组与HBV-DNA对比表

3 讨论

乙型肝炎的流行性、传染性受世界所关注，它直接增加了使患者发展成肝硬化、肝癌的几率。在我国，乙肝携带者达到将近10%，严重威胁着我国居民的身体健康，安全、高效的检测方法可帮助患者尽早确诊，对延缓疾病及疾病的传播有着重要的作用。当前，用于乙肝的检测方法较多，有实时荧光定量PCR法、化学发光法、酶联免疫法（ELISA）等，其中荧光定量PCR法可有效对HBV-DNA在机体复制情况进行测定，操作简单，有很高的利用率。ELISA法具有操作简单、成本低、高灵敏度等优势，但此检测只能达到定性的效果，无法对HBV感染具体情况进行判断，临床上常将ELISA法和PCR法联合应用[3]。

ELISA法是一种让抗体和酶复合物结合，通过显色来检测的方法，使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，使酶标抗原或抗体既保持酶的活性也保留其免疫活性。临床上常用ELISA法诊断HBV感染，它检测的是机体对HBV的免疫反应情况实时荧光定量PCR技术是指将荧光基因加入PCR反应体系，利用荧光信号积累实时监测PCR进程，最后通过曲线对未知模板进行定量分析，PCR是可准确的反映出HBV-DNA的、病程变化、复制水平以及预后判断等。当HBsAg为阳性，就表示存在HBV感染，如急慢性肝炎或无症状携带者。

本研究结果中，大三阳的阳性检出率高于小三阳组，且大三阳组的C值也高于小三阳组，由结果得知，大三阳患者体内的乙肝病毒非常活跃，有较强的传染性，同时也反映了HBsAg阳性和HBeAg阳性可对乙肝病毒的感染、传染得以反应。本研究结果还显示A、B、C三组的阳性检出率、Ct值比较，皆有差异，A组的阳性检出率最高，说明，HBeAg在乙肝患者体内的存在和HBV-DNA有非常紧密的联系，临床上可将HBeAg作为乙肝病毒在体内复制的依据，若其转阴，说明HBVDNA复制水平下降，可用于乙肝治疗效果和病情监测指导。若HBeAg为阴性，则患者乙肝病毒量减少，传染性降低[4]。无论HBeAg是阳性还是阴性，都需定期去医院复查，特别是HBeAg阳性患者，其乙肝病毒处于复制阶段，HBV-DNA浓度也高。HBcAb单一阳性标本，其HBV-DNA为阴性；单纯HBcAb阳性中，排除假阳性，可存在HBV-DNA低水平复制。HBsAg阴性HBV-DNA为阳性，提示，HBV的S基因发生突变，说明HBsAg检测试剂不能检出HBsAg,PCR检测在HBsAg出现前检出HBV-DNA的感染及乙肝病毒的传染性[5]。

综上所述，ELISA法检测免疫学指标，PCR法检测HBV-DNA，两种方法结合使用，可更准确的了解患者体内乙肝病毒复制情况，克服单一检测的局限性，尽早帮助患者确诊。