解郁升阳通窍方对慢性高眼压兔视网膜保护作用的研究

戴敏，亢泽峰，褚文丽，胡竹林，郑志坤，李妍

青光眼是当今世界上主要的致盲性眼病之一。通过药物或手术降低眼压是治疗青光眼的唯一有效措施，对于延缓青光眼的病程有明显效果。然而，单纯降眼压治疗并不能从根本上解决视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）死亡引起的视功能损害[1-2]。RGCs 的病理改变和凋亡在青光眼的发病过程中起着重要的作用，如何有效的保护视网膜及RGCs，对于青光眼的治疗具有重要意义。目前，西医在青光眼的视神经保护方面一直没有突破性进展，中医药临床应用历史悠久，治疗青光眼有其独到之处。大量的实验与临床研究[3-6]显示，中医药治疗不仅能够降低眼压，而且在青光眼视神经保护、视功能改善等方面具有很大的潜力和优势。本研究采用中医眼科专家亢泽峰教授在临床应用于青光眼患者视神经保护治疗的经验方——解郁升阳通窍方（Jieyu Shengyang Tongqiao formula，JSTF）对慢性高眼压兔进行干预，观察其对视网膜形态结构及RGCs 的保护作用。从而为JSTF 在青光眼的临床应用提供一定实验研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级成年新西兰大白兔（36 只，雌雄不限，体重2.5～3.0 kg），由昆明医科大学实验动物学部提供（动物许可证号：SYXK（滇）K2015-0002），实验动物的饲养和使用符合国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》。实验动物伦理审批号：KPRC-IACUC17008。

1.2 试剂与仪器

将150 mg 卡波姆-940（索莱宝公司）和1.25 mg地塞米松（索莱宝公司）配制成含0.025%地塞米松的0.3%复方卡波姆溶液50 ml，pH 值为4.0，高压灭菌，置于4℃冰箱保存备用。配制2%戊巴比妥钠溶液（戊巴比妥钠，德国默克公司），过滤除菌，置于4℃冰箱保存备用。盐酸奥布卡因滴眼液（日本参天制药公司），兔抗人Caspase-3 多克隆抗体（美国genetex 公司），苏木素-伊红染色实验相关试剂由云南省第二人民医院病理科提供；Tono-pen XL 笔式眼压计（美国Mentor 公司）。

1.3 实验药物

JSTF 药物组成：生黄芪50 g、当归尾9 g、柴胡9 g、枳实9 g、生白芍9 g、青皮6 g、郁金9 g、枸杞子12 g、石斛12 g、升麻6 g、冰片0.6 g（用酒溶化）。中药由云南省第二人民医院提供，中药浸膏由云南中医药大学制备。

1.4 方法

1.4.1 慢性高眼压模型的建立 兔耳缘静脉注射2%戊巴比妥钠20 mg/kg 麻醉动物，0.4%盐酸奥布卡因滴眼液滴眼局部麻醉。右眼为正常眼，左眼为实验眼。每眼均在1 ml 注射器角膜缘穿刺抽取0.1 ml房水后，正常组注射0.9%氯化钠注射液0.1 ml，高眼压模型组及各中药治疗组前房内注射0.3%复方卡波姆溶液0.1 ml。慢性高眼压模型以眼压升高大于22 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），并能持续1 周为标准[7]。模型组及中药治疗组如眼压<22 mm Hg，7 d后按上述方法重复注药1 次。

1.4.2 动物分组与处理 造模前用裂隙灯、显微镜、眼底镜检查眼前节及眼底无异常，Tono-pen XL 笔式眼压计连续测量眼压3 d，每日1 次，眼压＜17 mm Hg[8]的兔子方可采用。随机分为正常组（NG），模型组（MG），高、中、低浓度JSTF 治疗组（HCG、MCG、LCG）共5 组，每组6 只；另外还有6 只分别为建立高眼压模型1周组3 只，高眼压模型2 周组3 只。每日监测术眼眼压并观察眼前节变化，造模后1 个月处死动物，摘除眼球，观察相应指标。

JSTF 中药灌服：按照不同种实验动物间用药量换算方法[7]换算得到不同浓度JSTF 治疗组兔需灌服中药量（低浓度JSTF 治疗组：1.67 g·kg-1，中浓度JSTF治疗组：5.02 g·kg-1，高浓度JSTF 治疗组：15.06 g·kg-1）。造模成功后第1 d 开始给药，中药治疗组每日予JSTF 灌服；模型组以中浓度JSTF 治疗组等体积蒸馏水灌服；正常组不做处理，常规饲养。

1.5 苏木素-伊红染色观察视网膜组织形态变化

在模型建立后不同时间点（1 周、2 周、1 个月）及不同浓度中药治疗后，耳缘静脉注射空气处死动物，沿角膜缘剪开球结膜，分离眼球。将眼球置于40 g·L-1多聚甲醛固定24 h，脱水后加入适量包埋剂，制成石蜡切片。蒸馏水冲洗，苏木素染色5～10 min，自来水冲洗，10g·L-1盐酸乙醇分化30 s，自来水浸泡15 min，伊红复染2～5 min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，光学显微镜下观察眼球组织形态变化，并在显微镜下选取视盘周围5 mm 内的视网膜标本，置于400 倍显微镜下进行观察拍照，用10×10 目网格（1 mm2）计算10 个方格中RGCs 数量，每只眼计数3 张切片，每张切片取3 个视野，取平均值。

1.6 视网膜神经元Caspase-3 蛋白表达的检测

采用免疫荧光染色法，将眼球置于4%多聚甲醛固定2 h，之后去除眼前节组织继续固定24 h。30%蔗糖溶液脱水后加入冰冻包埋剂，制成冰冻切片。4%多聚甲醛固定30 min，1%TritonX-100 作用15 min，增加细胞膜的通透性，5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封闭30 min，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育l h，洗去多余的二抗，DAPI染核，最后用抗淬灭剂封片，倒置荧光显微镜下观察，细胞浆呈红色荧光为阳性细胞。用image pro plus 6.0 图像分析系统分析，对染色阳性物质进行荧光强度测定，在200 倍光学显微镜下每张切片随机选取5 个视野，计算平均荧光强度值。

1.7 统计学方法

采用GraphPad Prism 7.0 统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较用单因素方差分析，多组间的两两比较用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 眼压

注入0.3%复方卡波姆溶液后，兔眼压逐渐升高，3 d 后开始稳定升高，至模型建立1 个月后眼压仍可以维持在较高水平。造模后1 个月，各组间眼压比较差异有统计学意义（F=129.200，P=0.000）。与正常组比较，其他4 组眼压均升高，差异均有统计学意义（tMG=15.950，tLCG=20.950，tMCG=20.900，tHCG=15.230，均P=0.000）。与模型组比较，各JSTF 治疗组差异均无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 5 组眼压比较（，mm Hg，n=6）

表1 5 组眼压比较（，mm Hg，n=6）

注：* 与正常组比较，P＜0.05。JSTF 解郁升阳通窍方

2.2 眼前节的变化情况

造模后第1 d，角膜透明，角膜缘血管开始出现充血。随着造模时间延长，兔眼球结膜混合充血，角膜缘血管迂曲、扩张，角膜水肿，前房加深，瞳孔偏大。造模后1 周，部分兔眼前房出现灰白色团块状渗出，之后逐渐吸收。随着高眼压模型建立时间延长至1 个月时，兔眼结膜充血减轻，角膜缘血管迂曲扩张程度及角膜水肿也逐渐减轻（图1）。

图1 慢性高眼压模型兔的眼前节改变。1A 造模前；1B 造模后第1 d；1C 造模后1 周；1D 造模后2 周；1E 造模后1 个月

2.3 视网膜组织形态变化

造模前视网膜各层组织结构清晰，神经纤维排列整齐紧密，RGCs 排列紧密，细胞体积一般较大，边缘清楚，核呈圆形或略呈卵圆形，部分有明显核仁。造模后1 周，可见RGCs 部分消失，内核层神经细胞减少，可见空泡，视网膜开始变薄。之后随高眼压时间延长，RGCs 及内核层神经细胞进一步减少，视网膜进一步变薄。造模后1 个月，内层视网膜结构紊乱，RGCs 及内核层神经细胞大量丢失，视网膜明显变薄（图2）。

图2 高眼压模型建立不同时间点兔视网膜组织形态变化（×400）。2A 造模前；2B 造模后1 周；2C 造模后2 周；2D 造模后1 个月

造模后1 个月，采用不同浓度JSTF 治疗的模型兔眼内层视网膜结构紊乱减轻，RGCs 及内核层神经细胞数量增多，视网膜变薄程度减轻（图3）。

图3 造模后1 个月各组视网膜组织形态变化（×400）。3A 正常组；3B 模型组；3C 低浓度JSTF治疗组；3D 中浓度JSTF治疗组；3E 高浓度JSTF治疗组；JSTF 解郁升阳通窍方

2.4 视网膜RGCs 计数

造模后1 个月，5 组间RGCs 计数比较差异有统计学意义（F=3031.000，P=0.000）。与正常组相比，其他4 组RGCs 数量明显减少，差异均有统计学意义（tMG=164.800，tLCG=101.400，tMCG=64.190，tHCG=47.100，均P=0.000）；与模型组比较，不同浓度JSTF 治疗组RGCs 数量明显增多，差异均有统计学意义（tLCG=27.950，tMCG=53.790，tHCG=43.320，均P=0.000）；与低浓度JSTF治疗组相比，中、高浓度JSTF 治疗组RGCs 数量增多，差异均有统计学意义（tMCG=24.760，tHCG=22.410，均P=0.000）；与中浓度JSTF 治疗组相比，高浓度JSTF治疗组RGCs 数量升高不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）（表2）。

表2 5 组视网膜RGCs 计数比较（，个/10 mm2，n=6）

表2 5 组视网膜RGCs 计数比较（，个/10 mm2，n=6）

注：* 与正常组相比，P＜0.05；# 与模型组相比，P＜0.05；&与低浓度JSTF 治疗组相比，P＜0.05。RGCs 视网膜神经节细胞；JSTF 解郁升阳通窍方

2.5 视网膜Caspase-3 蛋白表达变化

根据2.4 所获得的结果，选择中浓度JSTF 对慢性高眼压模型兔进行治疗后，观察Caspase-3 蛋白表达变化。正常组、模型组及中浓度JSTF 治疗组均可见Caspase-3 蛋白阳性表达，表现为各层视网膜神经元胞浆红色荧光（图4）。正常组Caspase-3 蛋白仅有少量表达，中浓度JSTF 治疗组及模型组Caspase-3 蛋白荧光强度均较正常组明显增高（tMCG=79.470，tMG=19.820，均P=0.000），中浓度JSTF 治疗组Caspase-3 蛋白荧光强度较模型组降低（t=44.510，P=0.000）（表3）。

图4 造模后1 个月各层视网膜神经元Caspase-3 蛋白表达变化（×200）。红色荧光代表Caspase-3 蛋白的阳性表达；蓝色荧光代表DAPI 染色的视网膜各层细胞核；DAPI 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；Merge Caspase-3 与DAPI 染色的合成图；JSTF 解郁升阳通窍方

表3 3 组各层视网膜神经元Caspase-3 蛋白表达比较（，n=6）

表3 3 组各层视网膜神经元Caspase-3 蛋白表达比较（，n=6）

注：* 与正常组相比，P＜0.05；# 与模型组相比，P＜0.05。JSTF 解郁升阳通窍方

3 讨论

目前青光眼的病情进展仍然是以降眼压来控制。然而，控制眼压并不是唯一治疗目标。早期有效地进行视神经、视网膜的保护，减少RGCs 的凋亡，保护患者的视功能是治疗青光眼的最终目的。然而青光眼视神经保护的药物疗效存在一定的局限性。中医中药具有整体观念和辨证论治的治疗特色，其通过调节全身的脏腑、经络及精气血津液以改善机体的微环境，在保护视神经方面具有一定优势。亢泽峰教授认为肝肾虚损、脉络瘀滞是青光眼视神经损害的主要病机，故以“解郁开窍，升阳明目”作为青光眼视神经保护的首要治则。通过长期临床实践，总结并创立了青光眼视神经保护经验方“解郁升阳通窍方”。方中以黄芪、柴胡共为君药，益气健脾，疏肝解郁，升举阳气；当归具有补血活血之功，合黄芪可达补气生血、养血润目之效，白芍养血敛阴柔肝，合柴胡可达补血养肝，条达肝气之功，两者皆为臣药；枳实、青皮、郁金共奏疏肝理气、解郁开窍之功，枸杞子合石斛滋补肝肾、益精明目，共为佐药；后以升麻升举阳气、载药上行，冰片开窍解郁、引药上行为使。诸药共奏解郁开窍，升阳明目之功。

为进一步探讨JSTF 改善患者视功能的机制，课题组采用慢性高眼压兔来进行研究。结果发现，与正常组相比，不同浓度JSTF 治疗组的眼压与模型组无明显差异，说明JSTF 并无降眼压的作用。采用不同浓度JSTF 治疗后1 个月，兔眼内层视网膜结构紊乱减轻，视网膜变薄程度减轻，RGCs 数量也较模型组增多。说明JSTF 对慢性高眼压兔视网膜及RGCs 具有保护作用。Caspase 蛋白酶在哺乳动物细胞中介导凋亡，是触发细胞凋亡的关键酶[9-10]，有研究[11]发现，氧化应激在细胞凋亡中有着重要作用。活性氧的产生能够激活Caspase-3，激活Caspase 依赖性细胞凋亡，在触发神经元死亡中起关键作用[12-15]。研究发现，正常组Caspase-3 蛋白仅有少量表达，JSTF 治疗组及高眼压模型组Caspase-3 蛋白荧光强度均较正常组增高，而JSTF 治疗组Caspase-3 蛋白荧光强度较模型组降低。说明JSTF 对慢性高眼压兔RGCs 的保护作用可能与其能够抑制Caspase-3 的表达、减少RGCs 的凋亡有关。

本研究为JSTF 对青光眼患者视网膜及RGCs的保护作用提供了实验基础，为中药方剂对改善青光眼患者视功能的有效性提供了可靠依据。然而，JSTF 通过何种途径抑制Caspase-3 的表达以及如何减轻视网膜结构紊乱的具体机制仍需在以后的研究中进一步探索。