miRNA-4497靶向PEA15对视网膜母细胞瘤细胞增殖及药物敏感性研究

张丹，郭勇，岳以英，彭静，胡俊喜

视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,Rb）是一种儿童最常见的眼部恶性肿瘤，由视网膜未成熟细胞转化发展而来[1]。全球每15,000～20,000 个儿童中就有1 例发病，每年新增约有9,000 例患儿[2]。目前针对双眼Rb 的主要治疗方法包括化学疗法和局部疗法[3]，但是因为诊断不及时及耐药性等因素导致预后不理想。因此，阐明耐药性机制并寻找新的治疗靶标具有重要意义。微小RNA(microRNA,miRNA)是小的非编码RNA，长度约为19～25 个核苷酸，通过与靶标mRNA 的3' 端非编码区（3'untranslated regions，3'-UTR）结合并诱导转录抑制或降解来调节基因表达，在多种癌症中出现失调[4]。在喉鳞状细胞癌中，miRNA-4497 可以通过负调控GBX2 起到抑癌作用[5]。然而miRNA-4497 在Rb 中的研究甚少，最近研究表明，miRNA-4497 在Rb 中高表达[6]，但其具体功能尚不明确。本研究将探讨miRNA-4497 对Rb 细胞增殖及耐药的影响，并探究其分子机制。

1 材料与方法

1.1 标本来源

本研究所用到的27 例Rb 患者肿瘤组织及瘤旁视网膜组织标本，收集于2017 年1 月—2019 年12 月新乡医学院第一附属医院、第四军医大学唐都医院、天津市眼科医院、西安市第四人民医院4 家医院眼科经病理确诊为Rb 的患者。这项研究得到了医院的机构审查伦理委员会的批准，并且所有参加者均在注册后批准并签署书面知情同意书。

1.2 材料与仪器

人Rb 细胞株Y79 购自美国模式培养物集存库（ATCC）；RPMll640 培养基、胎牛血清均购自美国HyClone 公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega 公司；注射用奥沙利铂购自齐鲁制药(海南) 有限公司；CCK8 试剂盒购自日本同仁公司；GAPDH、PEA15 抗体及山羊抗兔IgG 购自美国Cell Signaling Technology（CST）公司；Lipofectamine3000 购自美国Invitrogen 公司；过表达miRNA-4497 慢病毒购自上海吉凯基因科技有限公司；野生型PEA15 基因3'-UTR 实验质粒、突变型3'-UTR 实验质粒、miRNA-4497-模拟物及miRNA-4497-阴性对照物购自长沙博楚生物科技有限公司。实时荧光定量PCR (realtime quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)试剂盒购自广州锐博生物有限公司。Infinite 吸光分度仪购自瑞士TECAN 公司。ViiATM7 Real-Time PCR System 购自美国ABI 公司。

1.3 细胞培养

Y79 细胞株使用含有10%胎牛血清的RPMll640 培基(其中含有1%的青霉素+链霉素)培养，培养条件为温度设定为37℃，CO2浓度设置为5%。取对数生长期的细胞进行后续实验。

1.4 细胞感染

将Y79 细胞株重悬于感染增强液中，保持密度为5×104个/mL，按照每孔体积为1 ml 接种到24 孔板中，按病毒感染复数（multiplicity of infection，MOI）=10，分别加入空载体病毒(阴性对照组)或miRNA-4497 过表达慢病毒(miRNA-4497 过表达组)混合液各3.5 μl，每孔均设置3 个复孔。培养8～16 h 后，更换培养基，继续培养及传代，使用嘌呤霉素筛选得到过表达及空载体病毒转染的Y79 细胞株，用于后续研究。

1.5 RT-qPCR 检测Y79 细胞株中miRNA-4497 和PEA15 的表达

采用RNA 抽提试剂盒提取病人组织标本总RNA，阴性对照组及过表达组Y79 细胞总RNA，按照说明书设置反应条件，先进行逆转录制备cDNA 文库，后按照RT-qPCR 试剂盒说明书操作，所用引物序列如下（表1）。实验结果采用2-△△Ct法进行统计分析。

表1 RT-qPCR 引物序列

1.6 CCK8 检测细胞增殖能力及对奥沙利铂药物敏感性

将感染后的细胞接种于96 孔板，密度为5×103个/孔，均设置3 个复孔，连续5 d 进行CCK8 检测。将感染后的细胞接种于96 孔板，接种浓度为5×104个/孔，均设置3 个复孔，每孔分别加入配置好的奥沙利铂溶液（浓度为0.125 μM、0.25 μM、0.5 μM、1 μM、2 μM），培养48 h 后进行CCK8 检测。检测前于每孔加入10 μl 的CCK-8 溶液，孵育3 h 后，吸光分度仪检测每孔细胞在450 nm 处的吸光度值。

1.7 双荧光素酶活性检测

利用TargetScan 网站（http://www.targetscan.org）对miRNA-4497 进行靶基因预测，其靶基因可能为PEA15。按照Lipofectamine 3000 说明书对Y79 质粒进行共转染，分为4 组：野生型+miRNA-4497 组、野生型+阴性对照组、突变型+miRNA-4497 组、突变型+阴性对照组，均设置3 个复孔，48 h 后，使用双荧光素酶报告实验试剂盒进行检测，分析4 组细胞的萤火虫荧光素酶活性及海肾荧光素酶活性。

1.8 Western blot 检测PEA15 蛋白表达水平

将转染后处于对数生长期的细胞收集，裂解后提取总蛋白，采用BCA 法进行细胞蛋白浓度定量。使用十二烷基硫酸钠聚烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE）进行电泳反应，随后进行转膜反应，转膜后使用快速封闭液封闭，加入一抗后，于4 ℃孵育过夜，于室温孵育二抗1.5 h。进行曝光显影。

1.9 统计学方法

采用GraphPad Prism 8 进行统计分析，所有实验数据采用均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，2 组间比较采用LSD-t 检验。当P＜0.05时，则认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miRNA-4497 在Rb 组织中高表达

采用RT-qPCR 共检测了27 例Rb 组织及27例癌旁视网膜组织标本，癌组织中的表达量（7.773±2.029）显著高于癌旁视网膜组织（1.977±0.380），比较有统计学意义（t=14.590,P=0.000）（图1A）。

2.2 RT-qPCR 检测感染后miRNA-4497 表达

通过慢病毒感染并使用嘌呤霉素筛选，使用RT-qPCR 验证，结果表明，相对于阴性对照组，过表达组细胞中miRNA-4497 表达增高，差异具有统计学意义（t=16.150,P=0.000），过表达组细胞构建成功（图1B）。

图1 miRNA-4497 基因表达情况。1A 转染前，** 瘤组织与正常组相比，P＜0.01；1B感染后，*** 与阴性对照组相比，P=0.000

2.3 miRNA-4497 对Y79 细胞增殖的影响

CCK8 法验证过表达miRNA-4497 后对Y79细胞增殖能力，相对于阴性对照组，过表达组细胞增殖速度从第3 d 开始明显增高，2 组细胞增殖速度的差异具有统计学意义（t3d=6.500,t4d=7.691,均P=0.000）。

2.4 miRNA-4497 对Y79 细胞药物敏感性的影响

采用CCK8 法检测奥沙利铂不同浓度下细胞的生长抑制率，在0.125 μM 时，2 组细胞生长抑制率的差异无统计学意义（P＞0.05），在浓度为0.25μM、0.5μM、1 μM、2 μM 时，过表达组细胞的生长抑制率比对照组低，且差异具有统计学意义(t0.25μM=4.277，t0.5μM=7.547,t1μM=8.302,t2μM=8.302；均P=0.000)（图2B）。

图2 CCK8 检测Y79 细胞的增殖能力及奥沙利铂的药物敏感性。2A Y79 细胞的增殖能力；2B 奥沙利铂对Y79 细胞的药物敏感性。** 与阴性对照组相比，P＜0.01，*** 与阴性对照组相比，P=0.000

2.5 荧光素酶活性检测结果

通过TargetScan 软件预测miRNA-4497 的靶基因可能是PEA15，miRNA-4497 种子区存在与PEA15 基因3’非翻译去互补配对序列，进而构建靶基因3’UTR 双荧光素酶报告质粒与突变质粒，通过双荧光素酶报告基因实验进行验证，野生型+miRNA-4497 组相对荧光素酶活性较阴性对照组显著降低，有统计学意义（t=5.514，P=0.000）（图3）。

图3 miRNA-4497 通过靶向PEA15 3’UTR 抑制PEA1 的表达。*** 与阴性对照组相比，P=0.000

2.6 过表达miRNA-4497 抑制PEA15 的mRNA 及蛋白表达

RT-qPCR 结果显示，相对于阴性对照组（0.910±0.023），过表达组（0.463±0.019）细胞mRNA 表达明显降低，差异有统计学意义（t=77.856,P=0.000）；Western blot 结果显示PEA15 蛋白水平明显降低（图4）。

图4 Western blot 和RT-qPCR 检测2组细胞中PEA15 的蛋白和mRNA 水平。4A PEA15 蛋白表达；4B PEA15 mRNA 表达量比较。*** 与阴性对照组相比，P=0.000

3 讨论

视网膜母细胞瘤（Rb）是与RB1 双等位基因缺失有关的视网膜恶性肿瘤，在血液和肿瘤样本中的突变检测率均为94.9%[7]。在过去的几十年中，人们一直在努力寻找新的治疗方法，但是目前仍面临着巨大挑战[8]。因此，阐明耐药的潜在机制，寻求Rb 的潜在治疗靶标至关重要。已有研究表明[9]，多种miRNA 的异常表达在Rb 的发病和进展中起着重要作用，miRNA-25-3p 通过抑制PTEN 促进Rb 细胞的恶性转化。miRNA-31 和miRNA-200a 可影响Rb 细胞的增殖能力[10]。然而，miRNA-4497 在Rb 细胞中的研究甚少。本研究结果证实，miRNA-4497 在Rb组织中高表达，初步表明在Rb 中具有促肿瘤作用。细胞生物学实验发现过表达miRNA-4497 可以显著促进Y79 细胞的增殖能力，并且降低对化疗药物奥沙利铂的药物敏感性，促进肿瘤增长及耐药。

miRNA-4497 于2010 年被发现[11]，后被报道其在感染不同类型结核分枝杆菌的THP-1 细胞中表达存在差异[12]。miRNA-4497 与滋养细胞凋亡和复发性流产相关[13]。近年来有其与肿瘤的相关报道[5，14-15]。在喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC）中，miRNA-4497 通过直接靶向GBX2 发挥肿瘤抑制作用。此外，miRNA-4497 的过度表达可激活细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）[5]。与LSCC 不同，本研究表明Rb 细胞中，miRNA-4497 可能充当“癌基因”发挥促肿瘤作用。同时发现，miRNA-4497 直接针对PEA15 的3’UTR 抑 制 其mRNA 表 达，Western blot 及RTqPCR 实验表明miRNA-4497 能够下调Rb 细胞中PEA15 的蛋白及mRNA 表达。初步证实miRNA-4497 影响Rb 的进展及耐药的机制是通过下调PEA15 发挥作用的。

PEA15 是一种小分子磷酸化蛋白，由130 个氨基酸残基组成，含有NH2 末端死亡效应域和分布在细胞质中的COOH 末端不规则结构。它的DNA 序列位于1q21-22 号染色体上，在哺乳动物基因序列中高度保守[14]。PEA15 在人体组织中广泛表达，并参与各种蛋白质之间的相互作用。它可以在体内通过发挥细胞因子的关键功能来调节细胞凋亡、增殖和葡萄糖代谢[15]。目前，已经发现PEA15 通过其死亡效应域（death effector domain,DED）和ERK1/2 靶向结合，抑制ERK1/2 磷酸化和核转移，从而发挥抗凋亡作用[16]。近年来，研究发现PEA15 的表达与几种类型的癌症密切相关[17]。例如，发现PEA15 蛋白在食管癌中含量很高，PEA15 的高表达缩短了患者的平均生存时间[8]。一些研究表明，PEA15 在肝[18]、肺[19]、乳腺癌[20]和卵巢癌[21]等肿瘤中高表达。PEA15 的磷酸化使ERK 磷酸化并促进肝癌细胞的增殖和侵袭，通过抑制caspase-3/7 活性降低了索拉非尼的抗肿瘤作用[22]，而PEA15 的未磷酸化状态抑制ERK 和表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的磷酸化，从而抑制了乳腺癌和卵巢癌的增殖，侵袭和转移及对雌激素耐药性[20-21,23]。此外，抑制PEA15 可以导致细胞周期停滞在S 期并且增强顺铂化疗敏感性[24]。本研究通过双荧光素酶报告实验证明，miRNA-4497 可与PEA15 基因3’非翻译区互补配对。在人Rb 细胞株Y79 中过表达miRNA-4497，则PEA15 表达降低，表明miRNA-4497 可以抑制PEA15 基因的表达从而发挥抗肿瘤作用。

大多数化疗药物通过诱导循环肿瘤细胞DNA损伤及抑制细胞DNA 修复过程发挥作用[20]。参与这些活性蛋白的miRNA 同样显示出了抗肿瘤作用，部分已进入了临床试验，例如miRNA-16 模拟物用于间皮瘤及非小细胞肺癌的治疗（NCT02369198）[25-26]。在本研究中，首次揭示了过表达miRNA-4497 通过直接靶向PEA15 来降低Rb 细胞的化疗敏感性。因此，未来可通过开发miRNA-4497 抑制剂增强抗肿瘤能力，有可能转化为Rb 化疗的辅助治疗药物。

综上所述，过表达miRNA-4497 可以明显促进人Rb 细胞株Y79 的增殖能力，并且降低了其对化疗药物奥沙利铂的药物敏感性，进一步发现其作用机制可能是通过靶向PEA15 发挥作用的。以上研究提示miRNA-4497 可能为Rb 的潜在治疗靶点，但仍需进一步实验证明。