VIGS技术在辣椒基因功能研究中的应用进展

李 杰，罗江宏，万子龙，杨 萍

(红河学院 生命科学与技术学院，云南 蒙自 661100)

我国是世界上辣椒第一生产国与消费国，辣椒播种面积约占世界的40%，在蔬菜中位居第一，是我国蔬菜产业中的第一大产业[1]。近些年来，辣椒产业发展较快[2-11]，不断培育具有高产、优质、抗病虫害、抗逆性强等优良性状的新品种是实现辣椒持续增产的关键。随着栽培辣椒基因组测序的完成、辣椒泛基因组的构建以及辣椒种质资源重测序数据的不断完善，研究优良基因和筛选良好的基因已成为辣椒分子生物学研究的热点[12]。随着分子生物学技术的不断突破，测序技术的进步和成本的降低，辣椒的基因测序在不断地进行，基因不断地被预测[13]。但在这些被预测到的基因中，大部分基因功能目前还没有得到验证。另外，辣椒存在遗传变异程度低、基因组变化大且复杂、染色体小等问题，难以进行细胞遗传研究，导致基因功能研究进展缓慢[14]。目前，辣椒基因组功能的研究方法相对缺乏，一些完善的基因研究技术难以在辣椒中使用，如使用农杆菌介导转基因法存在转化效果差、周期长等缺点。新兴的基因编辑应用存在系统不健全、技术难度高等问题。传统的转基因、基因敲除、反义抑制等基因功能研究方法在辣椒作物遗传转化中耗时费力且转化效率极低。而病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)技术研究周期短，不需要稳定的遗传转化过程，具有低成本、高通量等优势，且沉默之后表型症状明显[15]。利用该技术在辣椒中已鉴定或验证了上百种功能基因，极大地提高了辣椒基因功能的解析效率[16]。

鉴于此，根据国内外最新相关报道，着重对VIGS技术在辣椒作物生长发育、次生代谢、生物与非生物胁迫等方面研究中的应用进行综述，以期为VIGS在辣椒上的进一步应用提供依据。

1 VIGS技术和辣椒VIGS载体

1.1 VIGS技术介绍

VIGS利用携带植物功能基因cDNA侵染植物后可引起该植物靶基因沉默和表型变异，从而通过植物表型或生理指标的变化来反映该基因的功能[17]。VIGS最早是由KAMMEN首先描述病毒感染植株恢复正常的现象，但是该名词现在已经被专一应用于重组病毒导致内源基因表达减少这一技术[18-19]。在VIGS技术下，病毒载体携带的目的基因可使植物表达水平下降，根据病毒的复制和转录特异性基因序列同源诱导基因mRNA被分解或甲基化等修饰，引起植物的表型和生理指标的变化，导致植物出现靶基因功能丧失或表达水平下降，实现植物功能基因的鉴定，为基因功能研究提供了实用工具[20-21]。

1.2 辣椒VIGS载体及在辣椒中的应用

根据构建VIGS载体的病毒性质的不同，可以将其分为三大类：DNA病毒载体、RNA病毒载体和微卫星病毒载体。1995年，KUMAGAI等[22]首次完成了基于烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)的VIGS载体构建，利用重组TMV在本氏烟草(Nicotianabenthamiana)中成功沉默了植物内源八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturas，PDS)基因，由于PDS是类胡萝卜素合成途径中的一个关键酶，当PDS表达受阻时，植物便丧失了类胡萝卜素的光保护作用，会出现褪色现象，从而呈现出白化现象[23]。1998年，RUIZ等[24]将PDS cDNA插入马铃薯X病毒(Potato virus X，PVX)基因组中，重组病毒在VIGS中同样使本氏烟草产生白化现象，使植物源基因的表达得到有效抑制。随后RATCLIFF等[25]以烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)为载体构建了VIGS体系，TRV的基因组由RNA1和RNA2两部分组成，RNA1主要提供复制和移动功能，RNA2的主要功能是编码病毒外壳蛋白，TRV病毒载体还有一个明显的优势，即病毒能够在分生组织中迅速传播。迄今为止，TRV载体是使用最广泛的VIGS载体，与其他病毒载体相比，TRV-VIGS载体具有插入目的基因长、诱导基因沉默效率高、持久性长、对宿主不会造成明显伤害等优点[26]。在CHOI等[27]的研究中，建立了一个有效的病毒载体体系，该体系利用蚕豆枯萎病病毒2(BBWV2)进行辣椒瞬时基因沉默的研究，该体系设计了BBWV2作为双基因表达载体，同时在辣椒细胞中表达2种重组蛋白，此外，还建立了能够增强和稳定表达的重组蛋白，开发了基于BBWV2的VIGS载体，并成功在辣椒中使用BBWV2-VIGS载体沉默了PDS基因。通过测试不同条件下PDS基因沉默的效率，对辣椒BBWV2-VIGS系统进行了优化。该载体系统为辣椒基因功能的快速分析提供了一种简便的方法。以下列举了目前应用于辣椒上有效的病毒VIGS载体及接种方法(表1)。

表1 辣椒VIGS载体及接种方式

2 VIGS在辣椒功能基因组学研究中的应用

应用VIGS技术在辣椒中鉴定的基因功能涉及生长发育、代谢调控、生物胁迫及非生物胁迫应答等诸多方面，重点介绍在辣椒激素调节及生物和非生物胁迫应答等方面利用VIGS技术的研究进展(表2)。

表2 利用VIGS研究的辣椒基因及其表型

2.1 辣椒生长发育和次生代谢相关基因功能的研究

ZHANG等[31]通过研究辣椒花青苷合成转录因子基因(CaMYB)，发现利用VIGS技术沉默该转录因子基因能够抑制辣椒花青素的合成，表明CaMYB参与调控花青素的生物合成。MYB转录因子在植物体内不仅调控植物的生长发育，还对植物的抗病性起重要作用。辣椒素不仅是辣椒果实风味品质的重要指标，还在辣椒生长中起防虫防病的自我防御作用。茉莉酸(JA)在调控辣椒果实辣椒素的代谢信号转导中起非常重要的作用，其调控因子R2R3-MYB的转录因子基因CaMYB108主要在辣椒果实和花中表达，但是CaMYB108基因的下游信号没有确定，利用VIGS技术沉默CaMYB108基因后导致辣椒素生物合成基因CBGs表达量降低，同时辣椒素含量也相对减少。CaMYB108基因沉默植株的花药开裂延迟，花粉活力降低。通过双荧光素酶报告基因检测发现，CaMYB108基因靶向启动CBGs基因。另外，茉莉酸甲酯诱导CaMYB108和CBGs基因的表达，证实了CaMYB108基因参与辣椒素的合成以及雄蕊发育的功能[32]。在ALSV(苹果潜伏球形病毒)介导的VIGS体系中，将氨基酸转移酶基因(pAMT)导入ALSV病毒载体，该病毒成功侵染辣椒植株，侵染率在80%～90%，pAMT沉默植株的辣椒素含量和辣椒素酯积累减少。研究结果表明，ALSV病毒能够用于构建VIGS体系来研究辣椒素积累的调控机制，从而可以在辣椒育种上通过基因改造提高辣椒素的含量[16]。DEL等[33]利用瓦斯蒂克辣椒黄脉病毒(Pepper huasteco yellow veinsvirus，PHYVV)沉默辣椒素合成相关基因Pun1、Comt、Kas和AMT之后，沉默植株中辣椒素含量显著下降，由此推测，这些基因对辣椒素合成有积极作用。

2.2 辣椒生物胁迫相关基因功能的研究

CaPHL8是一种MYB转录因子，被认为是辣椒对青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)防御的阳性调节因子。ALI等[34]在辣椒系统发育评价和利用VIGS技术对该基因功能鉴定的研究中揭示了CaPHL8在辣椒防御进化中的作用，同时通过氨基酸序列分析发现，CaPHL8与其他植物中MYB家族转录因子的相似性最大。辣椒植株在遭受青枯雷尔氏菌攻击时，CaPHL8表达会上调。青枯雷尔氏菌侵染下CaPHL8沉默植株GUS活性检测也证实了这一现象；通过VIGS技术对CaPHL8功能的研究证实，辣椒植株免疫力降低，植物生长受到损害，同时伴有高致病菌生长，在该基因沉默的植物中，辣椒免疫功能的减弱伴随着防御相关标记基因转录的减少。同时，瞬时过表达CaPHL8(35S:CaPHL8-ha)可引起辣椒过敏反应，过表达植株表现出产量高和免疫增强的表型。Western blot结果证实了CaPHL8-ha蛋白的稳定表达，此外，与其他转录因子不同的是，CaPHL8不参与高温胁迫的耐受功能。

研究表明，辣椒WRKY家族转录因子涉及辣椒的抗病反应，缺乏辣椒转录因子WRKY1基因，会减少地毯草黄单胞杆菌(Xanthomonasaxonopodis)生长[35]。HUH等[36]利用TRV病毒介导的VIGS技术沉默辣椒WRKYd基因，发现沉默会影响TMV-P0介导的超敏反应，以及沉默辣椒WRKYd基因会导致发病相关基因与过敏反应相关基因的表达降低，揭示了Btf3基因和WRKYd基因作为调控因子控制过敏反应和病原物传播的机制。LIM等[37]利用VIGS技术，发现辣椒抗旱相关的DIN1基因存在于辣椒叶中，与以前的研究不同，高盐处理可引起DIN1显著表达。辣椒CaWRKY45参与抗病的基因功能也利用VIGS技术得以验证[38]。

昆虫的食草性会严重阻碍植物的生长发育，降低作物产量。蓟马是植物病毒病原的重要载体，也是危害性极强的农作物害虫。SARDE等[39]研究了辣椒脂氧合酶基因CaLOX2对辣椒防御西方花蓟马的作用，结果显示，CaLOX2参与JA的生物合成并介导植物抗性，蓟马摄食诱导JA相关基因CaLOX2和CaPINⅡ表达，通过VIGS技术沉默辣椒植株中的CaLOX2基因，与正常植株相比，蓟马取食时茉莉酸及其衍生物显著减少，CaLOX2沉默的辣椒植株对蓟马的敏感性增强，从而揭示了CaLOX2基因依赖JA的信号传导增强植株对蓟马的防御机制。

2.3 辣椒非生物胁迫相关基因功能的研究

MADS-box家族转录因子在植物的生长发育中起重要作用，一些MADS-box基因参与了植物的胁迫反应。目前，辣椒中与抗逆相关的MADS-box基因家族信息较少，CHEN等[40]从辣椒中分离出1个MADS-box转录因子基因，并将其命名为CaMADS，利用VIGS技术沉默辣椒植物CaMADS基因后，发现沉默植株中该基因的表达量下调。在低温、氯化钠和甘露醇胁迫处理后，CaMADS基因沉默植株受到的伤害比正常植株严重，并且表现出电解质泄漏增加、丙二醛(MDA)水平升高和叶绿素含量降低的现象。进一步说明CaMADS在低温、盐和渗透胁迫信号通路中起着积极的应答作用。

脱水蛋白(DHNs)作为第2组晚期胚胎发生丰富蛋白(LEA)的一个亚家族，因其在植物抗非生物胁迫方面的作用而受到广泛关注。LUO等[41]的研究表明，CaDHN5(辣椒脱水基因)的表达受盐和渗透胁迫的强烈诱导，但其功能尚不清楚。为了解CaDHN5在非生物胁迫中的作用，利用VIGS技术下调了辣椒和转基因拟南芥(Arabidopsis)植株中CaDHN5的表达。研究发现，沉默CaDHN5可以抑制锰超氧化物歧化酶(MnSOD)和过氧化物酶(POD)基因的表达。这些变化引起的活性氧在VIGS系统中的积累比在胁迫条件下的对照组多。与野生型相比，过表达CaDHN5的植物对盐和渗透胁迫的耐受性增强，盐和渗透胁迫相关基因的表达也相对增加，从而证明了CaDHN5在盐和渗透胁迫信号通路中的正向调节作用。

JOO等[42]利用VIGS技术和转基因拟南芥研究相关蛋白质的生物学功能，发现CaATBZ1具有负调控ABA信号和干旱胁迫响应的作用。与CaATBZ1沉默辣椒植株一样，CaASRF沉默辣椒植株通过ABA介导的信号转导显示出耐旱表型。CaASRF1介导的泛素化在调控CaATBZ1的稳定性中起着至关重要的作用，这些发现为研究转录因子的翻译后调控提供了分子基础。CaWRKY27基因在辣椒逆境胁迫中具有很重要的作用，其能够正调控植物对细菌性青枯病的抗性，同时负调控植株的耐热性。研究者利用VIGS技术沉默CaWRKY27基因，发现沉默的辣椒植株对盐胁迫和渗透胁迫抗性显著增强，还发现CaWRKY27不仅在辣椒逆境胁迫中是转录激活因子，还能够编码抗逆境阻遏蛋白[43]。F-box蛋白基因CaDIF1可以由ABA、干旱胁迫、H2O2和NaCl胁迫诱导表达，CaDIF1沉默株系展示出干旱敏感性，而超表达株系展示出ABA敏感性和干旱耐性。利用酵母双杂试验确定了CaDIS1在细胞质和细胞核中与CaDIF1存在互作。CaDIF1和CaDIS1沉默株系展示出对ABA的不敏感性和降低的干旱耐性，叶片气孔变大和蒸腾速率增加，进一步说明CaDIF1和CaDIS1互作参与依赖ABA信号转导的干旱胁迫抗性过程[44]。

3 VIGS技术在辣椒研究应用中的展望

近些年，VIGS技术已经为辣椒相关基因的瞬时调控和功能分析提供了技术平台，在基因功能的研究领域显示出了巨大的优势，利用该方法对辣椒基因组功能基因验证的研究也在不断地深入。VIGS的沉默效率很大程度上依赖于寄主植物与病毒之间的相互作用，此外还与寄主的生长环境，以及病毒积累的环境密切相关。辣椒与侵染它的病毒载体之间的匹配程度对VIGS的沉默效率具有重要影响。目的基因片段的长度以及该片段在整个基因全长中所处的位置也影响着VIGS的基因沉默效率。携带目标基因片段的重组病毒载体构建后，病毒载体在操作过程中的接种技术、病毒载体的接种时期、农杆菌介导转化的活性以及接种后培养环境等，均对基因沉默效率有一定影响。

虽然VIGS技术在辣椒基因功能鉴定方面的应用取得了重大进展，但是仍存在较多无法忽视的缺点，这些缺点限制了VIGS技术的应用，如几乎不可能实现完全抑制目的基因的表达；基因家族成员之间的功能冗余可掩饰目的基因的沉默；受感染的植株和复检不能表现一致的沉默水平；沉默基因的表型可能受病毒影响；易受环境影响，如温度和湿度升高导致效率下降[58]。这些问题都是在今后的VIGS技术研究中所要面临并需逐步解决的难题。在未来，随着植物中VIGS技术研究的深入和VIGS体系的优化，VIGS技术必将成为高通量基因功能鉴定的重要工具。