鹅星状病毒XX株的分离鉴定及遗传特征分析

金前跃，郭永刚，李俊朋，秦保亮，王寅彪，郭振华，王 丽，邢广旭，邓瑞广，张改平,8

(1.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002； 2.河南省农业科学院 中英禽病国际研究中心，河南 郑州 450002； 3.江苏高校动物重要疾病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009；4.河南牧业经济学院 动物医药学院，河南 郑州 450046； 5.平顶山市农业科学院 畜牧研究中心，河南 平顶山 467001；6.新乡市动物疫病预防控制中心，河南 新乡 453003； 7.新乡医学院 公共卫生学院，河南 新乡 453003；8.河南农业大学 动物医学院，河南 郑州 450002)

鹅星状病毒(Goose astrovirus，GAstV)属于星状病毒科(Astroviridae，AstV)、禽星状病毒属(Avastrovirus，AAstV)，是一种无囊膜、单链正义RNA病毒[1]。GAstV基因组全长6.1～7.9 kb，包含5′非翻译区(UTR)、3′UTR及多聚腺苷酸(PolyA)尾及3个开放性阅读框(ORF)，分别为编码蛋白酶的ORF1a、编码RNA聚合酶的ORF1b、编码衣壳蛋白(Capsid)的ORF2[2-4]。禽星状病毒主要分为3个群，分别为禽星状病毒1群(AAstV-1)、禽星状病毒2群(AAstV-2)和禽星状病毒3群(AAstV-3)[5]。GAstV属于禽星状病毒1群(AAstV-1)，是一种新发的星状病毒。

GAstV主要感染5～20日龄的雏鹅，临床表现为严重痛风症状。剖检病死雏鹅，可见内脏器官表面有大量尿酸盐沉积，部分死亡雏鹅关节腔内有白色尿酸盐沉积，死亡率高达20%～70%[6-10]。

2017年以来，雏鹅痛风病例在山东、江苏、安徽、河南、辽宁、广东等主要养鹅地区不断出现，且呈上升趋势，对国内养鹅业造成了巨大影响。国内多家科研单位相继分离到GAstV，ZHANG等[11]从华南地区分离到了GD株，YANG等[12]和ZHANG等[13]分别从华北地区分离到了AstV/SDPY/Goose/1116/17、AAstV/Goose/CHN/2017/SD01株，徐蓉等[14]从华东地区分离到了JSHA株。河南省多地也出现了雏鹅痛风疫情，病死鹅表现出典型的内脏痛风症状，给河南省养鹅产业造成了重大损失。

为明确GAstV河南流行株的基因组特征，从河南省新乡市原阳县某鹅场采集了患有痛风的病鹅样品，通过盲传和PCR检测分离了GAstV，并对分离毒株进行全基因组测序和遗传特征分析，为有效防控雏鹅痛风疫情提供技术支持,并为GAstV在河南省的流行病学研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

DME/F12培养基购自HyClone公司；青链霉素混合液、胰蛋白酶购自Solarbio公司；胎牛血清购自Gibco公司；Premix ExTaqDNA聚合酶、病毒基因组提取试剂盒(MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0)、反转录试剂盒(PrimeScript RT Master Mix)购自Takara公司。

1.2 病料和细胞

患有痛风的雏鹅来源于河南省新乡市原阳县某鹅场。解剖后，收集肝脏、肾脏等组织，冻存于-40 ℃冰箱。鸡肝癌细胞系(LMH)由本实验室保存，利用含10%胎牛血清的DME/F12培养基于含5% CO2的37 ℃培养箱中进行培养。

1.3 病料的处理

无菌条件下取适量病料，以1∶3的质量体积比加入含青链霉素的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)彻底研磨。将组织研磨液收集于无菌Eppendorf管中，在-80 ℃和室温间反复冻融3次，10 000 r/mim离心15 min，使用0.22 μm的滤器过滤上清液并冻存于-80 ℃冰箱。

1.4 病毒的分离

待细胞瓶中的LMH细胞生长至约80%时，弃去培养基并用无菌PBS清洗3次。使用无血清DME/F12(含1 mg/L胰酶)培养基将上述处理后的病料研磨液稀释50倍后接种于细胞上，在37 ℃、5% CO2的培养箱中孵育1.5 h。然后弃去病毒液，加入含2%胎牛血清的DME/F12(含1 mg/L胰酶)培养基继续培养72 h。之后通过-80 ℃与室温间反复冻融，2 000 r/min离心15 min，收集病毒液。无菌过滤后，再次接种于LMH细胞盲传3代，然后继续传至第6代，获得稳定毒株。

1.5 病毒的鉴定

1.5.1 PCR检测 根据AstV/SDPY/Goose/1116/17毒株(GenBank登录号：MH052598.1)的RNA聚合酶基因ORF1b序列设计引物。PCR上游引物序列为5′-ACCCCTGGTTATCCAAAATTTAAGT-3′，下游引物序列为5′-CCGCCAGAAGAGAGGCTTGGGCAAC-3′，预期片段大小为420 bp。

按照病毒核酸提取试剂盒说明书提取病毒总RNA，使用反转录试剂盒进行反转录，获取病毒cDNA作为PCR模板。PCR反应条件：预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，循环30次；72 ℃延伸10 min，4 ℃停止反应。GAstV ORF1b阳性质粒与PBS分别作为阳性对照及阴性对照。采用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。

1.5.2 全基因组测序 按照病毒基因组提取试剂盒说明，提取GAstV的全基因组，反转录后交由杭州联川生物进行全基因组二代测序。

1.6 遗传特征分析

根据分离毒株的全基因组测序结果进行遗传特征分析，主要包括同源性分析、系统进化分析、ORF2编码蛋白氨基酸序列比对。本研究所用毒株序列信息见表1。

表1 研究所用毒株序列信息

续表1 研究所用毒株序列信息

1.6.1 同源性分析 利用DNAStar软件MegAlign中的Clustal W Method模块，将分离株的全基因组、ORF1b、ORF2的核苷酸及氨基酸序列与GenBank中相关序列进行同源性分析。

1.6.2 系统进化分析 将分离株的全基因组序列与GenBank中禽星状病毒相关序列进行比对。利用Mega 6.06软件中的Clustal W程序完成分离株全基因组序列比对，并采用邻接法构建遗传进化树，步长值(Bootstrap value)设置为1 000。

1.6.3 ORF2编码蛋白氨基酸序列比对 利用DNAStar软件MegAlign功能的Clustal W Method模块，将分离毒株与GenBank中GAstV流行毒株的ORF2编码蛋白氨基酸序列进行多重比对分析。

2 结果与分析

2.1 患痛风雏鹅临床解剖特征

患病雏鹅解剖后可见明显的全身性痛风症状，肾脏肿大、发白，输尿管、胆囊、关节腔内都有尿酸盐沉积，心脏、肝脏、腺胃、肠道也不同程度附着有白色尿酸盐(图1)。

2.2 分离毒株PCR鉴定结果

将处理过的病料研磨液接种LMH细胞(未见明显的细胞病变)，收集1—6代病毒液，提取核酸并反转录获得cDNA，进行PCR检测后，均扩增得到了420 bp大小的条带(图2)，符合预期大小。表明成功分离了1株GAstV，命名为XX株。

M.DNA Marker；1—6.1—6代收集的病毒液；7.阳性对照；8.阴性对照

2.3 分离毒株全基因组序列分析

本研究分离的GAstV XX株(GenBank登录号：MN337323)的基因组全长为7 252 bp，包含长度为245 bp(1—245)的5′UTR和228 bp(7 025—7 252)的3′UTR，ORF包括ORF1a(246—3 350)、ORF1b(3 341—4 891)、ORF2(4 910—7 024)。ORF1a、ORF1b编码非结构蛋白，包含蛋白酶、RNA聚合酶等，ORF1a和ORF1b之间有10 bp的重叠序列；ORF2编码病毒结构蛋白，主要包括衣壳蛋白及其表面的刺突蛋白(Spike)。

2.4 分离毒株遗传特征分析

2.4.1 同源性分析 全基因组及各基因序列的同源性分析结果(表2)表明，GAstV XX株基因组与导致雏鹅痛风的代表性毒株GD、AstV/SDPY/Goose/1116/17、AAstV/Goose/CHN/2017/SD01的核苷酸同源性分别为98.1%、98.7%、98.7%。GAstV XX株的ORF1b、ORF2基因与导致雏鹅痛风的代表性毒株GD、AstV/SDPY/Goose/1116/17、AAstV/Goose/CHN/2017/SD01核苷酸同源性为98.6%～ 99.4%，氨基酸同源性为98.6%～ 99.8%。可见，GAstV XX株与当前导致雏鹅痛风的流行毒株同源性较高。

表2 分离毒株与代表性毒株的同源性

2.4.2 系统进化分析 为进一步确定GAstV XX株与其他毒株的遗传进化关系，构建了基于基因组的系统进化树(图3)。系统进化分析结果显示，GAstV XX株与当前导致雏鹅痛风的GD、AstV/SDPY/Goose/1116/17、AAstV/Goose/CHN/2017/SD01等毒株处于同一进化分支，属于禽星状病毒1群。

图3 GAstV的系统进化分析

2.4.3 ORF2编码蛋白氨基酸序列比对 GAstV XX株的ORF2编码蛋白氨基酸序列与其他流行毒株同源性较高，但也存在一些氨基酸位点的突变(表3)。这些突变主要集中在224(T→A)、225(Q→R)、379(P→T)、424(M→I)、464(N→A)、594(S→N)等位点。

表3 ORF2编码蛋白氨基酸序列比对

3 结论与讨论

禽星状病毒可感染鸭[15]、鸡[16]、火鸡[17]等多种禽类，临床常表现为肝脏、肾脏及肠道病变，但GAstV感染报道较少。本次暴发的GAstV感染可引起雏鹅严重痛风症状，在禽星状病毒中尚属首次发现，与营养性痛风不同[18]，其具有极强的传染性，即使在低蛋白质日粮情况下也可发生。本研究分离了1株GAstV，对病毒进行了全基因组测序，并对其遗传特征进行了分析。

前人研究发现，鸡星状病毒可引起LMH细胞病变[16]。本研究中，GAstV XX株能在LMH细胞上稳定传代，但病毒感染不引起细胞病变，具体原因有待进一步研究。通过全基因组序列分析可知，GAstV XX株基因组全长7 252 bp，主要编码ORF1a、ORF1b、ORF2蛋白。GAstV XX毒株与当前导致雏鹅痛风的流行毒株同源性较高，均在97%以上，与代表性毒株GD、AstV/SDPY/Goose/1116/17、AAstV/Goose/CHN/2017/SD01的基因组核苷酸同源性分别为98.1%、98.7%、98.7%。

系统进化分析结果表明，GAstV XX株与当前导致雏鹅痛风的流行毒株处于同一进化分支，属于禽星状病毒1群，与鸭、火鸡、鸡星状病毒进化关系较远，存在较大差异。不同鹅源毒株ORF2编码蛋白氨基酸序列分析表明，各流行毒株之间差异较小，仅存在部分氨基酸位点的突变。