氮磷营养盐对铜绿微囊藻和斜生栅藻生长及竞争的影响

2021-07-22束浩然

江西农业大学学报 2021年3期

谢静，程燕，查燕，汤婕*，束浩然，，

（1.安徽农业大学，安徽合肥 230036；2.安徽省合肥市环境监测中心站，安徽合肥 230001；3.杭州市农业科学研究院，浙江杭州 310024）

【研究意义】富营养化是自然演变的过程，随着人类活动的加剧使得湖泊富营养化成为自然演变过程的浓缩[1]。近些年来，我国各地湖泊、养殖池塘等淡水水体都处于富营养化状态，其中洪泽湖、太湖、巢湖已达富营养程度，鄱阳湖和洞庭湖为中营养水平[2]。富营养化进一步导致湖泊蓝藻暴发，并呈迅猛发展的趋势。当蓝藻暴发时，蓝藻成为水体中的优势种，抑制其他藻类生长[3]，此外，蓝藻水华还将导致水体中的溶解氧下降，导致大量水生生物死亡，破坏水体质量[4]。蓝藻还会释放毒素，能够直接危害人体健康[5]。因此，防控蓝藻水华成为环境科学领域研究的重点和难点问题。【前人研究进展】大量研究表明，蓝藻暴发与pH、光照、温度、营养盐等多种因素有关[6]，其中氮（N）、磷（P）营养盐是影响蓝藻暴发的关键因子[7-9]。氮、磷营养盐作为防控蓝藻水华的可控手段，相关学者对其如何影响蓝藻生长进行了报道。Liu等[10]研究发现，N、P 质量比为200 时能够控制蓝藻生长，而N 质量浓度为10 mg/L 且N、P 质量比等于16时，蓝藻得到最大细胞产量。孔欣等[11]研究发现N、P 质量浓度分别为2.65，0.53 mg/L 时，铜绿微囊藻的密度达到最大值。Chen 等[12]研究发现，总P 质量浓度在0.1 mg/L 以上时，铜绿微囊藻的繁殖速度明显加快。此外，有机污染物也是影响藻类生长的关键因素[13]，如低浓度PAHs 可以作为铜绿微囊藻（Mcirocystis aeruginosa）的生长促进因子[14]，其中低浓度芘胁迫下的铜绿微囊藻的生长受到明显促进，且pH=9.0时，其生长率最高[15]。李尚等[16]研究发现再生水中含有氮磷营养物质，景观回用过程中可能会加剧藻类水华爆发风险。许海等[17]研究发现太湖中溶解态有机磷浓度占比较高，有利于蓝藻形成优势。马浩天等[18]研究发现与沉水植物共培养条件下，斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）的生长受到显著的抑制作用。【本研究切入点】由此可见，铜绿微囊藻和斜生栅藻作为湖泊中常见的藻类，由于极易繁殖，被认为是引起水华现象的主要藻种[19]。【拟解决的关键问题】本研究通过配制不同氮磷比（质量比）的培养液培养铜绿微囊藻和斜生栅藻，通过观察藻细胞数及增长率，探究不同氮磷比对两种藻类在纯养和混养模式下生长的影响，以期为蓝藻水华暴发防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 藻种与培养基

试验用铜绿微囊藻取自中国科学院水生生物研究所（武汉）淡水藻种库，斜生栅藻取自中山大学污染与恢复生态学实验室。实验以BG-11 培养基为基础，先配制成无磷、无氮的培养基，再用硝酸钠和磷酸氢二钾配制成实验所需的氮磷比例。

1.2 试验设置

在正式试验前进行饥饿培养。将饥饿培养的铜绿微囊藻，斜生栅藻以5 000 r/min离心5 min，去掉上清液；再用15 mg/L 的NaHCO3。溶液洗涤2 次，去掉上清液，去除吸附性的营养，用无菌水将藻种稀释至接种所需的藻细胞浓度。藻种的初始密度定为5.0×104个/mL。

1.3 试验方法

将经过饥饿培养的铜绿微囊藻细胞，斜生栅藻分别接种到含有0，0.5，1.0，5.0，10.0 mg/L 磷（即0，3.68，7.36，36.84，73.68 mg/L 的磷酸氢二钾）和氮元素固定在25 mg/L 的BG-11 培养液中，培养液处于以磷为标准的富营养状态和超富营养状态。在温度为（25±5）℃，光照强度为2 000 lx，光暗比为12 h∶12 h的条件下培养22 d。观察铜绿微囊藻和斜生栅藻细胞数的变化情况，用血球计数板进行计数。

1.4 比生长速率计算

藻细胞增长率（μ）指在某一时间间隔内藻类生长的速率。

式中：X1为某一时间间隔开始时的铜绿微囊藻细胞现存量（个/mL）；X2为某一时间间隔终结时的铜绿微囊藻细胞现存量（个/mL）；t2-t1为某一时间间隔（d）。

1.5 生长曲线拟合

以逻辑斯谛方程拟合藻类的增长过程，先进行参数预估，以每组处理的最大生物量（Nmax）作为公式中K估计值，应用逻辑斯谛方程的对数形式，采用最小二乘法进行回归分析，获得方程截距a和斜率r的估计值。

式中：N为藻类生物量；K为最大生物量；r为内禀增长率；t为培养时间。

1.6 种间竞争参数

种间竞争优势用相对生长速率判别，其计算公式为[20]:

式中K为生长速率常数，Nt为培养t天后的藻密度（ind·L-1），No为藻初始密度（ind·L-1），K1为纯养藻类时铜绿微囊藻对斜生栅藻的生长速率，KA、Kc分别为纯养时铜绿微囊藻和斜生栅藻的生长速率常数，K2为混养时铜绿微囊藻对斜生栅藻的生长速率，K'A、K'c则为混养时二者的生长速率常数。

1.7 数据处理

试验数据以“平均值±标准差”表示，数据处理均采用SPSS21 统计软件中one-way ANOVA 进行方差分析，LSD’s多重比较检验各试验组间是否具有显著差异（P＜0.05），图用original 9.0绘制。

2 结果与分析

2.1 纯养和混养模式对两种藻类最大生物量的影响

如图1、2所示，当N/P=（50∶1～2.5∶1）时，纯养下铜绿微囊藻和斜生栅藻的最大生物量均显著大于混养（P＜0.05）。N/P=5∶1 和N/P=25∶1 组，纯养下铜绿微囊藻和斜生栅藻的最大生物量均显著大于其他组。在5 组氮磷比下，纯养铜绿微囊藻和斜生栅藻的最大生物量均显著大于混养模式。由此可见，两种藻类在混养时有明显的竞争性抑制。

图1 不同氮磷比对铜绿微囊藻最大生物量的影响Fig.1 Effects of different N/P ratios on the maximum biomass of Microcystis aeruginosa

在0 mg/L 磷浓度下，两种藻类均不能生长。纯养下，N/P=5∶1 组铜绿微囊藻的最大生物量达656×104g/mL；混养下，N/P=25∶1 组铜绿微囊藻的最大生物量达387×104g/mL。纯养下，N/P=25∶1组斜生栅藻的最大生物量达462×104g/mL；混养下，N/P=25∶1 组斜生栅藻的最大生物量达208×104g/mL。由此可见，在氮质量浓度相同，不同氮磷比对两种藻类的最大生物量均具有显著影响（P＜0.05）（图3），并随着磷浓度的升高，纯养和混养下两种藻类的最大生物量具有显著性差异（P＜0.05）。且无论在纯养或混养，铜绿微囊藻对斜生栅藻呈现出强烈的抑制作用，其最大生物量均显著高于斜生栅藻，究其原因，一方面由于微囊藻细胞是圆形，比斜生栅藻具有更大的比表面积，有利于吸收较多的营养和光照，因此具有较高的生物量[21]。另一方面，铜绿微囊藻能够适应营养盐缺乏的特殊机制，在高氮磷比浓度下能够摄取过量磷储存在细胞为后续生长繁殖提供能量，因此在与斜生栅藻的竞争中占有优势。此外，铜绿微囊藻分泌藻毒素，对斜生栅藻产生的他感作用也使得其在竞争中占有优势[22]。

图2 不同氮磷比对斜生栅藻最大生物量的影响Fig.2 Effects of different N/P ratios on the maximum biomass of Scenedesmus obliquus

图3 不同氮磷比对铜绿微囊藻和斜生栅藻最大生物量的影响Fig.3 Effects of different N/P ratios on the maximum biomass of Microcystis aeruginosa and Scenedesmus obliquus

2.2 纯养和混养模式对两种藻类比生长速率的影响

由图4 可知，无论在纯养或混养，N/P=1∶0 组铜绿微囊藻和斜生栅藻均难以生长，甚至出现负增长率。混养铜绿微囊藻在12～14 d 期间的比生长速率最大，后期呈现下降趋势。N/P=2.5∶1 组两种藻类的增长率仅保持在0.3 左右，在第7 天出现明显的下降趋势，在第9 天其增长率趋近于零。在前期阶段，斜生栅藻增长率要低于铜绿微囊藻，后期增长率有所提高，说明斜生栅藻受制于水体中磷含量，与高玉荣等[23]研究结论一致。在培养第10天，混养两种藻类的比生长率出现最大值。在培养22 d，纯养或混养下两种藻类的比生长率呈下降趋势。从第2 天开始，N/P=5∶1 组两种藻类的增长率处在较为平稳状态，从第6天开始铜绿微囊藻的增长率有所下降，而斜生栅藻在整个培养过程中均处在较低水平，可能与磷浓度的升高抑制其生长有关。N/P=25∶1组铜绿微囊藻的增长率一直保持在0.4左右，从第6天开始出现明显的下降趋势，而在第9天其增长率接近于零。在前期阶段，斜生栅藻的增长率要低于铜绿微囊藻，后期增长率有所提高，说明斜生栅藻适合在较低的磷浓度中生长。在N/P=50∶1 组的接种初期，纯养和混养培养下的铜绿微囊藻和斜生栅藻均表现出较高的增长率，但总体增长率较低。从第6 天开始，两者增长率明显下降，第7 天后增长率趋近于零，甚至出现负增长。总体上，混养培养下的斜生栅藻增长受到铜绿微囊藻的影响，其增长率低于纯养模式。

图4 不同氮磷比对铜绿微囊藻和斜生栅藻比生长速率的影响Fig.4 Effects of different N/P ratios on the specific growth rate of Microcystis aeruginosa and Scenedesmus obliquus

2.3 纯养和混养模式对两种藻类生长曲线的影响

不同氮磷比下铜绿微囊藻和斜生栅藻的生长曲线见图5，N/P=1∶0组，随着培养时间的增加，纯养或混养两种藻类的细胞密度均呈不同幅度的增长趋势，但藻细胞数仅能维持在接种时的密度范围内。在培养第18 天，纯养斜生栅藻的细胞密度最大，但随后斜生栅藻逐渐死亡，细胞密度密度逐渐下降。在N/P=2.5∶1 组，在培养初期（2～6 d），两种藻类的细胞密度增长缓慢，从培养第8 天后，两种藻类的细胞密度呈现出不同幅度的增长趋势。值得注意的是，纯养铜绿微囊藻的细胞密度增幅最大，在培养第22天时其密度达到最大值。总体上，无论是纯养或混养铜绿微囊藻的细胞密度大于斜生栅藻，且混养斜生栅藻的细胞密度增幅较为平缓。在N/P=5∶1和N/P=25∶1组，两种藻类的细胞密度增长曲线一致。在培养6 d后，两种藻类的细胞密度逐渐升高，以纯养铜绿微囊藻的细胞密度增幅最大。在第20 天，纯养斜生栅藻的细胞增幅出现最大值。在N/P=50∶1 组，从培养第14 天后，除纯养斜生栅藻之外，纯养和共养铜绿微囊藻、斜生栅藻的细胞密度增长平缓。在培养第20天，纯养斜生栅藻的细胞密度值最大。总体上，在混养下铜绿微囊藻和斜生栅藻的细胞密度均小于纯养，说明两种藻类之间存在竞争关系。

图5 不同氮磷比对铜绿微囊藻和斜生栅藻生长曲线的影响Fig.5 Effects of different N/P ratios on the growth curve of Microcystis aeruginosa and Scenedesmus obliquus

2.4 铜绿微囊藻和斜生栅藻的种间竞争关系

铜绿微囊藻和斜生栅藻的相对生长速率如图6所示，除N/P=1∶0组之外，自培养第8天始其他4组的KR值在1～2，说明铜绿微囊藻具有竞争优势，但随培养时间的延长高氮磷比（N/P=25∶1和N/P=50∶1）下KR值趋近于1，说明两种藻类无竞争性。在培养16～18 d 期间，N/P=1∶0 组的KR值呈上升趋势，说明此阶段铜绿微囊藻表现出明显的竞争优势。培养第14天时，在N/P=1∶0培养条件下，KR值低至-3.39，是由于斜生栅藻的生物量小于初始值，此时铜绿微囊藻仍具有竞争优势。

图6 铜绿微囊藻对斜生栅藻的相对生长速率Fig.6 Relative growth ratio of Microcystis aeruginosa to Scenedesmus obliquus

3 讨论

研究显示，氮和磷是影响藻类生长的重要限制因素，且氮和磷的作用也是相互的[24]。代瑞华等[25]研究表明，在磷质量浓度相同，不同氮磷比条件下，氮限制会对铜绿微囊藻生物量产生不利影响，在低氮浓度下铜绿微囊藻的生物量显著降低。而本研究结果显示，在氮质量浓度相同，不同氮磷比的低磷浓度（N/P=50:1）下铜绿微囊藻和斜生栅藻的生长均受到抑制。Chen 等[12]发现低浓度的氮、磷可以控制铜绿微囊藻的生长，且间接产生二甲胂酸此类毒物有关。孔欣等[11]研究发现低质量浓度（氮磷分别为0.03，0.006 mg/L）下铜绿微囊藻的生长速率最低，与本研究结论一致。当N/P=25:1 和N/P=5:1 时，两种藻类均能正常生长。但在N/P=2.5:1 时，两种藻类的生长再次受到抑制。因此，氮、磷质量浓度过高反而抑制两种藻类的生长。这是由于氮、磷质量浓度具有一定的阈值范围，两者浓度过高使得藻密度达到饱和，导致其生长速率降低。同时，在高密度下藻类易产生有毒代谢物，不利于藻类生长[26]。

此外，孔欣等[11]研究得出，氮磷比越高，铜绿微囊藻的生长速度越快。孙凯峰等[27]研究得出，在氮、磷其中1 种丰富充足情况致使不同氮磷比的情况下，会改变铜绿微囊藻的生物量，使其成为优势种，降低了生物群落的多样性。N/P=5:1 时，铜绿微囊藻的生长受到明显的抑制。究其原因，是由于培养中的氮含量不能充分满足藻类生长繁殖的需求，因此铜绿微囊藻的生长受到抑制。本研究选取的低浓度N/P=50:1下斜生栅藻所达到的峰值与磷适宜浓度达到的峰值差距较小，说明斜生栅藻比微囊藻更适宜在低磷浓度条件下生长。由此可见，斜生栅藻生长比铜绿微囊藻需要更多的氮源以维持细胞增殖，与许海等[17]结论一致。王敏等[28]研究发现，氨氮浓度的降低使得藻占比逐渐下降，而蓝藻逐渐成为优势种，也与本研究结论一致。研究发现，斜生栅藻比铜绿微囊藻需要更多的氮源来维持细胞增殖[17]。从铜绿微囊藻对斜生栅藻的相对生长速率KR值来看，本试验中除N/P=1:0 组之外，自培养第8 天始其他四组的KR值在1～2，说明铜绿微囊藻具有竞争优势。因此，高氮磷比有利于铜绿微囊藻生长。有研究发现湖泊氮磷质量比低于13[29-30]，那么蓝藻将会占优势，高于这一比值，蓝藻在整个藻类的生物量占比就会下降[30]。从本研究得出的KR值可知，随着培养时间的延长，高氮磷比（N/P=25:1 和N/P=50:1）下KR值趋近于1，说明铜绿微囊藻生物量占比下降，其对斜生栅藻的抑制减弱。因此，在低磷浓度环境中易暴发斜生栅藻，而高磷浓度环境中更易暴发铜绿微囊藻，且两种藻类的竞争优势明显，这与Smith[29]提出的理论基本一致。许海等[31]研究显示当湖泊水体中存在较高浓度的生物可利用磷时，铜绿微囊藻具备独特的生理生态特征，在藻类竞争中具有优势，且能保持较长时间的指数增长及生物量的增加，从而为水华创造有利条件。