微波对没食子酸和PPO相互作用特性的影响

2021-07-22候增超原江锋1b赖钰婷王大红1b龚明贵

河南科技大学学报(自然科学版) 2021年6期

候增超，原江锋,1b,2，赖钰婷，王大红,1b,2，龚明贵,2，张彬,2

(1.河南科技大学 a.食品与生物工程学院;b.微生物资源开发与利用重点实验室,河南洛阳 471023；2.东部战区总医院药理科，江苏南京 210002)

0 引言

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)的酶促反应是加工产品贮存过程中引起褐变的主因之一[1]。一系列的不利变化不仅使加工产品品质劣变，而且酚类化合物的氧化褐变导致营养物质的生物利用度降低，因此，有效抑制PPO活性对于延缓酶促褐变和提高加工产品品质是一种非常有效的途径[2]。对于PPO的钝化和抑制一直是研究的关注点[3-8]。

多酚是植物体内的次级代谢产物，已受到国内外不同领域学者的广泛关注[9]。文献[10]研究表明：多酚类化合物如没食子酸在PPO的作用下能够氧化成醌类化合物，醌再经非酶促聚合发生褐变，影响加工产品的品质和多酚的生物利用率。没食子酸作为一种广泛应用的多酚类化合物，近年来一直是研究的重点[11-12]。因此，研究加工产品体系中多酚与PPO之间的相互作用，对于提高加工产品多酚的生物利用率，以及含多酚食品的加工显得尤为重要。文献[13]研究了微波场对蛋白质品质、结构以及功能等方面的影响，但微波对于加工产品中PPO活性的影响以及微波对酚酸类化合物和PPO混合体系的影响尚无文献报道。

本文以微波辐射作为抑制和钝化PPO的技术手段，分析不同没食子酸浓度、pH和温度对PPO体系中PPO活性的影响，同时研究没食子酸对PPO酶学性质的影响，并且进一步研究不同微波功率对没食子酸和PPO体系特性的影响。本研究可为进一步探究微波辐射对PPO抑制机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

多酚氧化酶(>600 U/mg)购于安徽酷尔生物有限责任公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和邻苯二酚为分析纯，购于天津市德恩化学试剂有限公司；没食子酸购于天津市大茂化学试剂厂。

XH-MC-1型实验室微波合成仪，北京祥鹄科技发展有限公司；Agilent Cary Eclips型荧光分光光度计，安捷伦科技有限公司；L5S型紫外分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；STARTER 3100型pH计，上海奥豪斯仪器有限公司；HH-SA型电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 储备液的配制

用浓度为50 mmol/L的磷酸缓冲液(pH6.8)将PPO溶解，配成浓度为0.007 8 mmol/L的PPO溶液。称取不同质量的没食子酸分别溶解于50 mmol/L的磷酸缓冲液(pH6.8)中，配制成浓度分别为0.078 mmol/L、0.118 mmol/L、0.234 mmol/L、0.312 mmol/L和0.390 mmol/L的没食子酸溶液，备用。

1.2.2 PPO活性的测定

PPO活性的测定参照文献[14]的方法，并略有修改。将0.2 mL、2 mmol/L的邻苯二酚溶液和2.7 mL、50 mmol/L、pH6.8的磷酸缓冲溶液混合作为反应底物，提前将底物溶液置于37 ℃恒温水浴15 min。将反应底物分别与0.1 mL没食子酸和PPO溶液快速混合，立即在420 nm测定吸光度，5 min后再次测定其吸光度。酶活力的定义：单位时间内，每毫升酶液吸光度变化0.001定义为1个酶活力单位。

1.2.3 不同浓度没食子酸对PPO活性的影响

室温下，对没食子酸与PPO的浓度比分别为0、10、15、30、40和50的溶液分别进行PPO活性测定，测定方法同1.2.2。混合后，PPO终浓度为0.003 9 mmol/L，没食子酸终浓度分别为0.039 mmol/L、0.059 mmol/L、0.117 mmol/L、0.156 mmol/L和0.195 mmol/L。

1.2.4 不同pH对没食子酸与PPO体系酶活性的影响

室温下，选取没食子酸与PPO浓度比为50的体系，分别配制pH为5.7、6.0、6.5、6.8、7.2和7.4的磷酸缓冲液(50 mmol/L)，按1.2.2方法测定活性，空白对照为对应pH的磷酸缓冲液。

1.2.5 不同温度对没食子酸与PPO体系酶活性的影响

室温下，选取没食子酸与PPO浓度比为50、pH6.8的体系，分别在温度20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃，水浴20 min，按1.2.2方法测定活性。

1.2.6 没食子酸与PPO体系中淬灭类型、结合常数、结合位点和热力学参数的计算

取不同浓度没食子酸与PPO混合溶液体系的储备液，分别在25 ℃和35 ℃下静置反应2 h。然后检测各混合溶液体系的荧光光谱。荧光光谱的仪器参数：激发波长λex为280 nm，激发与发射狭缝宽度均为10 nm，电压为600 V，发射波长λem为290～450 nm。PPO的荧光淬灭过程使用Stern-Volmer方程[15]分析。对于静态淬灭，当生物小分子与大分子相结合时，结合常数Ka与结合位点数n通过Lineweaver-Burk双对数方程进行计算[16]。

生物大分子和小分子之间的相互作用力包括4种，分别为疏水作用力、静电作用、氢键和范德华力。如果焓变在测定温度范围内变化不大，则没食子酸与PPO相互作用过程中的焓变(△H)、熵变(△S)和吉布斯自由能(△G)，可使用Van’t-Hoff方程计算[17]。

1.2.7 荧光光谱分析

取不同浓度没食子酸与PPO混合溶液体系的储备液，分别在25 ℃和35 ℃下反应2 h，分别测定混合物体系的荧光光谱。微波处理条件：取没食子酸与PPO浓度比为50的混合溶液，分别在微波功率100 W、300 W、500 W、700 W和900 W(50 ℃，8 min)下测定微波处理后混合液的荧光光谱。测定荧光光谱设定的仪器参数：激发波长λex为280 nm，激发和发射狭缝宽度均为10 nm，发射波长λem为290～450 nm；同步荧光激发波长扫描范围为260～310 nm；三维荧光扫描模式为3-D Scan，激发波长λex为250～450 nm，发射波长λem为250～450 nm，激发和发射狭缝均为10 nm，扫描速率为120 nm/min。

1.2.8 紫外吸收光谱分析

使用没食子酸与PPO的浓度比为0、10、15、30、40和50的混合溶液，室温下静置反应2 h；取没食子酸与PPO浓度比为50的混合溶液体系，分别在微波功率100 W、300 W、500 W、700 W和900 W(50 ℃，8 min)下进行处理，在波长265～315 nm扫描各混合物紫外吸收光谱。

1.2.9 不同微波功率对没食子酸与PPO体系中酶活性的影响

取没食子酸与PPO浓度比为50的混合溶液，分别在微波功率100 W、300 W、500 W、700 W和900 W(50 ℃，8 min)下进行处理。按1.2.2方法测定酶活性。

1.2.10 不同微波功率对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除的影响

参照文献[18]的方法，并略有变动。取没食子酸与PPO浓度比为50的混合溶液，分别在微波功率100 W、300 W、500 W、700 W和900 W(50 ℃，8 min)下进行处理，然后分别取微波处理后的混合溶液1 mL，加入0.004% DPPH溶液3 mL，充分混匀，避光静置30 min后，以甲醇为空白对照，于517 nm波长处测吸光度。

1.2.11 数据分析及处理

每个试验均重复3次，使用SPSS软件分析。采用Orign 2017软件制图。

2 结果与分析

2.1 没食子酸与PPO体系酶学性质

2.1.1 不同浓度没食子酸对PPO活性的影响

没食子酸对PPO活性的影响如图1a所示，随着没食子酸浓度的增加，PPO的活性不断下降。当没食子酸与PPO浓度比为10时，PPO活性降低为原酶活性的84.8%；而当没食子酸与PPO浓度比为50时，PPO活性降低为原酶活性的58.5%。没食子酸与PPO浓度比为50时，没食子酸的浓度是0.195 mmol/L，溶于pH6.8磷酸缓冲液溶液中，此时磷酸缓冲液溶液的pH值为6.5，对溶液体系的pH影响不大，可以忽略不计。因此，造成PPO活性变化的原因，可能是由于没食子酸对PPO活性中心的螯合作用引起的。文献[14]也报道了不同浓度柠檬酸对PPO活性具有较强的抑制作用。

2.1.2 不同pH对没食子酸和PPO体系酶活性的影响

pH值是影响酶催化的重要因素，过高和过低的pH值会影响酶的构象，致使酶变性失活。由图1b可知：PPO活性对pH值较为敏感，在pH5.7～7.4时，PPO的活性呈现先上升后下降的趋势，且pH值在6.8时，PPO活性最大。pH值过高或者过低，活性反应速率下降，说明可以通过调节富含PPO的溶液pH来抑制PPO的活性，从而达到控制体系中由于PPO的存在而引起的酶促褐变。PPO催化没食子酸发生酶促反应，最适宜pH为6.8。文献[19]报道蘑菇中PPO最适pH值为7.0，这与本试验结果基本一致。

2.1.3 不同温度对没食子酸和PPO体系酶活性的影响

为了研究没食子酸和PPO体系中温度对PPO活性的影响，选取温度为20～70 ℃，测定没食子酸和PPO体系中PPO活性。如图1c所示，PPO活性随着温度的升高，呈现先上升后下降的趋势，温度较低时，PPO活性较小，可见低温有利于抑制PPO活性；当温度升高到50 ℃时，PPO的活性达到最大；当温度>50 ℃时，活性逐渐降低，而70 ℃时活性几乎完全丧失，这可能是因为过高的温度导致PPO变性，从而严重影响PPO的活性。这与文献[20]的研究结果基本一致，即在70 ℃时酶活性几乎完全丧失。因此，低温和较高的温度可以抑制PPO活性。

(a) 没食子酸 (b) pH (c) 温度

2.1.4 内源荧光光谱和淬灭类型确定

PPO分子中含有色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等一系列可以发射内源荧光的氨基酸残基，因此，可以通过内源荧光的变化来反映没食子酸与PPO之间的相互作用以及没食子酸所引起PPO的构象变化。图2为没食子酸处理PPO的荧光光谱和Stern-Volmer图。图2a中，A→F线表示曲线所对应的没食子酸与PPO浓度比分别为0、10、15、30、40、50的变化方向。由图2a可知：随着没食子酸浓度的增加，荧光发射强度逐渐降低，表明没食子酸的加入使PPO发生酶促氧化，并且使PPO发生荧光淬灭。图2b为没食子酸与PPO相互作用的内源荧光光谱与Stern-Volmer方程拟合图。图2b中，F0为未加入没食子酸时PPO的荧光强度；F为加入不同浓度没食子酸时PPO的荧光强度；Q为没食子酸的浓度，mmol/L。不同处理条件对PPO活性的影响见表1。从表1可以看出：在没食子酸与PPO的相互作用过程中，拟合后的R2均为0.98，表明F0/F与Q之间呈现良好线性关系且斜率为正值，故没食子酸与PPO是静态淬灭机制；并且随着处理温度的升高，淬灭常数KSV值却随之下降，25 ℃和35 ℃时PPO淬灭速率常数Kq分别为8.7×1011和4.6×1011，淬灭常数随着温度的升高而下降[21]，且均远高于2×1010，进一步表明没食子酸对PPO的淬灭机制为静态淬灭。

(a) 内源荧光发射光谱 (b) Stern-Volmer方程拟合图

表1 没食子酸与PPO相互作用的Stern-Volmer常数

2.1.5 没食子酸与PPO相互作用的结合常数和结合位点数

没食子酸和PPO相互作用的结合常数(Ka)及结合位点数(n)见表2。没食子酸和PPO之间存在较强的结合力，并且随着温度的升高，Ka随之增大。结合位点数n分别为1.398和1.714，结合位点数n接近2，说明没食子酸与PPO大约有2个结合位点数，n伴随温度的升高有一定的改变，说明温度的升高对结合位点数有一定影响。没食子酸与PPO作用的结合常数Ka均远大于104数量级，表明没食子酸和PPO具有较强的相互作用。

表2 没食子酸和PPO相互作用的结合常数

2.1.6 没食子酸和PPO相互作用的热力学参数和作用力类型的分析

小分子化合物与蛋白质的相互作用模式和作用力类型，可以用热力学参数(如△H、△S和△G)来指示。当△H>0且△S>0时，主要作用力为疏水作用力；当△H<0且△S>0时，静电引力起主要作用；当△H<0且△S<0时，氢键和范德华力起主要作用；反应过程中，当△G<0，则表明反应是自发进行[17]。没食子酸与PPO相互作用的热力学参数见表3。由表3可知：没食子酸和PPO相互作用后，△H>0，△S>0且△G<0，说明没食子酸和PPO反应是自发进行的，并且主要作用力为疏水作用力。

表3 没食子酸与PPO相互作用的热力学参数

2.2 微波对没食子酸和PPO相互作用的紫外吸收光谱

没食子酸和PPO相互作用的紫外吸收光谱如图3a所示，A→F线表示没食子酸浓度变化的方向，随着没食子酸的加入，PPO的吸收峰强度增高。在不添加没食子酸的情况下，285 nm是PPO的特征吸收峰。随着没食子酸溶液浓度的升高，PPO的吸光度逐渐增加，但是特征吸收峰的位置未改变。由此可见，没食子酸的加入会与PPO发生酶促氧化，并且使PPO内部暴露了疏水性的酪氨酸与色氨酸残基，致使吸光度增强。

图3b为经过不同微波功率处理后PPO和没食子酸的相互作用紫外光谱。在100～700 W时，没食子酸和PPO体系的紫外吸光度逐步增加，这可能是由于微波处理后，部分色氨酸和酪氨酸残基在亲水环境暴露导致；而在用900 W处理后紫外吸收强度降低，这可能是由于部分去折叠化的PPO分子在较高的微波功率下又发生了团聚，结果使部分暴露于较为亲水环境的色氨酸和酪氨酸残基又被包埋入疏水环境中。文献[22]研究也发现蛋白质的紫外光谱和分子折叠结构相关，去折叠可以引起紫外吸收强度的降低。紫外吸收光谱表明，不同微波功率处理PPO和没食子酸体系通过影响PPO结构，进而影响PPO和没食子酸体系中酶促氧化。

(a) 不同没食子酸浓度处理 (b) 不同微波功率处理

2.3 微波对没食子酸和PPO相互作用的荧光光谱分析

蛋白质的内源荧光是由其内部色氨酸和酪氨酸残基激发产生的，因此，可以通过内源荧光的变化来反映PPO与没食子酸之间的酶促反应以及PPO构象的变化。没食子酸和PPO相互作用荧光光谱分析见图4。图4a中，随着没食子酸浓度的增加，内源性荧光发射强度逐渐降低，表明随着没食子酸的加入，PPO发生荧光淬灭。荧光团附近的分子微环境可以用同步荧光光谱来指示。如果将激发与发射波长之间的差值Δλ设置成15 nm与60 nm，则得到的同步荧光光谱分别表示蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的光谱特征[23]，所以可以用来辨别蛋白质构象变化的情况。如图4b和图4c所示，当Δλ=15 nm以及Δλ=60 nm时，随着没食子酸浓度的增加，PPO的特征吸收峰降低，并且最大发射波长并没有发生明显改变，说明没食子酸并没有使酪氨酸残基与色氨酸残基周围极性改变，但是通过内源性荧光和同步荧光的改变，证明没食子酸使PPO构象和微环境发生变化，可能是由于没食子酸使PPO的其他氨基酸残基的微环境发生改变造成的。

不同微波功率处理PPO与没食子酸体系的荧光光谱如图4d所示，在100～700 W时，荧光强度随微波处理功率的增加从125降低到90，这种现象可能是由于PPO结构的展开和芳香族氨基酸在微波辐照后，暴露于强极性水溶液中而又被包埋入疏水环境中所致。经微波处理后，内源性荧光光谱显示没食子酸与PPO混合溶液的特征吸收峰从348 nm红移至356 nm，表明微波辐射能够影响PPO构象，进而影响到PPO和没食子酸体系中酶促氧化。

(a) 不同浓度没食子酸处理PPO (b) 同步荧光光谱(Δλ=15 nm)

三维荧光光谱可以准确有效地检验蛋白质结构与微环境的改变。图5a与图5b分别为PPO和没食子酸以及PPO体系的浓度比为30时的三维荧光光谱。这两个体系中都含有“山脊”峰(峰A)，也就是存在特征为Δλem=Δλex的瑞利散射[24]。如图5a所示，峰B在Δλem=348 nm处出现，这是由PPO中氨基酸的π-π*跃迁所造成的。图5b中峰B的荧光强度显著降低且λem发生轻微蓝移，表明PPO的结构和周围微环境发生变化，这与同步荧光光谱的结果相对应。

(a) PPO的三维荧光 (b) 没食子酸与PPO结合的三维荧光

2.4 微波功率对没食子酸和PPO体系中PPO活性的影响

不同微波功率对PPO活性的影响如表4所示，随着微波功率的增加，PPO的活性逐步降低。与未经微波处理的PPO活性相比，100～300 W PPO活性升高，这可能是由于低功率微波下体系温度起主要作用，处于最合适温度下的PPO高于未经处理的PPO活性；随着微波功率的升高，微波功率起主导作用，过高的微波功率影响PPO的构象，从而使PPO活性逐步降低。文献[25]也报道了高功率微波辐射使牛蒡PPO的活性降低的现象。综上可知，低的微波功率对没食子酸和PPO体系中PPO活性有一定的促进作用，而高微波功率能够钝化没食子酸和PPO体系中PPO的活性。

表4 微波功率对没食子酸与PPO体系PPO活性和DPPH清除的影响

2.5 微波功率对没食子酸和PPO体系中清除DPPH自由基的影响

DPPH自由基是一种化学性质较为稳定的自由基[18]。由表4可知：没食子酸和PPO体系对DPPH自由基具有一定的清除能力，并且随着微波功率的增加，清除DPPH自由基能力逐步增强。可能是由于没食子酸和PPO体系中没食子酸具有清除DPPH自由基能力，并且体系中PPO具有酶促氧化没食子酸的能力。经微波处理，体系中PPO构象发生改变，活性受到影响，因此使部分没食子酸没有发生酶促氧化，进而具有一定的清除DPPH自由基的能力；随着微波功率的增加，PPO的活性受到较大的影响，因此更多的没食子酸不发生酶促氧化，故显示出逐步增高的DPPH自由基清除能力。