吴茱萸HPLC指纹图谱的建立及基原鉴别研究

戚华文，徐 鑫，高德嵩，王 引，金红利, ，王超然, ，刘艳芳, ，梁鑫淼,

1.中国科学院大连化学物理研究所中国医药城生物医药创新研究院，江苏 泰州 225300

2.中国科学院大连化学物理研究所, 辽宁 大连 116023

吴茱萸为常用温里药之一，具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻的功效，临床上常用于治疗厥阴头痛、寒疝腹痛、寒湿脚气，经行腹痛等症[1]。吴茱萸所含的化学成分类型较多，包括生物碱、柠檬苦素、萜类、黄酮等，其中生物碱和柠檬苦素类化合物是其主要活性成分。目前《中国药典》2020年版中收录了芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa(Juss.) Benth.、石虎Euodia rutaecarpa(Juss.) Benth.var.officinalis(Dode) Huang或疏毛吴茱萸Euodia rutaecarpa(Juss.) Benth.var.bodinieri(Dode) Huang的干燥近成熟果实作为吴茱萸的3种基原药材[2-4]。这3种药材在中国南部各地均有广泛分布，是吴茱萸商品药材中的主流品种，但吴茱萸的质量品质与不同基原的相关性还缺少充分的实验研究，不同产地的生长环境、气候条件可能会造成不同基原吴茱萸药材的质量差异[5-6]。

对于吴茱萸药材的质量控制多集中于吴茱萸碱、吴茱萸次碱和柠檬苦素的含量测定，《中国药典》2020版中将这三者的含量作为质量评价的指标，但3种吴茱萸药材的化学成分极为相似，仅通过个别成分的含量测定很难实现吴茱萸药材基原的鉴别，也难以对其内在品质进行客观评价，因此建立一种准确全面的质量控制方法尤为重要。定量指纹图谱是目前中药质量评价的主要方向之一，将指纹图谱与多指标成分定量结合起来，从而实现对中药质量的有效全面控制[7-8]。目前有关吴茱萸指纹图谱的研究已有部分报道[9-11]，而采用HPLC定量指纹图谱结合化学计量学分析吴茱萸基原的报道较少。

本实验采用HPLC建立29批吴茱萸的定量指纹图谱，并利用液质联用技术对共用峰的化学结构进行鉴定，结合相似度评价和化学计量学方法，对不同基原的吴茱萸进行分析，为吴茱萸的质量控制及科学的临床使用提供更多依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters Alliance高效液相色谱系统，包括2695梯度泵，2998二极管阵列检测器，自动进样器，柱恒温系统，Empower色谱工作站。MS204TS电子分析天平（梅特勒-托利多有限公司），岛津超高效液相色谱系统，SPD-20A紫外检测器，AB SCIEX X500系列QTOF质谱仪。

色谱柱：Tnature-ACCHROM C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm, 美国沃特世公司）和Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm, 美国安捷伦公司）

1.2 试药

对照品吴茱萸碱（批号B266，规格20 mg，质量分数99.20%）、吴茱萸次碱（批号B935，规格20 mg，质量分数99.40%）、去氢吴茱萸碱（批号5451，规格20 mg，质量分数98.0%）、水仙苷（批号4016，规格20 mg，质量分数98.0%）购自上海诗丹德标准技术服务有限公司。对照药材吴茱萸（批号120909-201510，0.5 g/支）购自中国食品药品检定研究院；吴茱萸药材共29批，采自湖南、江西省峡江县、江西省刘公庙等地，质量符合《中国药典》2015年版。经中国科学院大连化学物理研究所杨小平鉴定为芸香科植物吴茱萸E.rutaecarpa(Juss.)Benth.、石虎E.rutaecarpa(Juss.) Benth.var.officinalis(Dode) Huang或疏毛吴茱萸E.rutaecarpa(Juss.) Benth.var.bodinieri(Dode) Huang的干燥近成熟果实。具体信息见表1。

表1 29批吴茱萸样品信息Table 1 Samples information from 29 batches of Evodiae Fructus

乙腈（4 L，色谱级）、甲醇（4 L，色谱级）均购自Sigma-Aldrich。甲酸（500 mL，色谱级）购自Aladdin。实验室用水来自Milli-Q超纯水净化系统（Billerica公司，美国）。

2 方法

2.1 色谱和质谱条件

2.1.1 HPLC-DAD色谱条件 色谱柱为Tnature-ACCHROM C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美国沃特世公司），流动相乙腈（A）-0.5%甲酸溶液（B）洗脱，0～21 min，5%～27% A；21～24 min，27%～48% A；24～35 min，48%～55% A；35～50 min，55%～90% A；50～60 min，95% A；体积流量1.5 mL/min；进样量为10 μL；柱温为30 ℃；检测波长为252 nm。

2.1.2 HPLC-QTOF-MS质谱条件 液相条件与上述相同。离子源：ESI离子源；正离子模式；气帘气241 kPa；Gas 1：448 kPa；Gas 2：448 kPa；温度620 ℃；离子化压力5500 V，去簇电压80 V；全扫描范围：m/z50～1500；裂解电压40 V。CE Spread：20 eV。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢吴茱萸碱、去氢吴茱萸碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成含吴茱萸碱80 μg/mL、吴茱萸次碱80 μg/mL、去氢吴茱萸碱80 μg/mL和水仙苷80 μg/mL的混合溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取吴茱萸药材粉末（过3号筛）约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，称定质量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）60 min，放冷，再称定质量，用75%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取同一批（S1）次吴茱萸药材，制备供试品溶液，连续进样6次，记录特征图谱。各特征峰的相对保留时间RSD均小于1%，主要特征峰的相对峰面积RSD小于5%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取同一批（S1）次吴茱萸药材，制备供试品溶液，分别于0、6、12、18、24 h注入液相色谱仪，记录特征图谱。各特征峰的相对保留时间RSD均小于1%，主要特征峰的相对峰面积RSD小于5%，表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验 取同一批（S1）次吴茱萸药材，制备6份供试品溶液，进样，记录特征图谱。各特征峰的相对保留时间RSD均小于1%，主要特征峰的相对峰面积RSD小于5%。

3 结果与分析

3.1 吴茱萸指纹图谱的建立

取29批吴茱萸样指纹图谱供试品溶液，分别按“2.2.2”项制备供试品溶液，每份样品平行2次，按“2.1.1”项的方法依次进样检测，获得吴茱萸药材的HPLC指纹图谱（图1）。将统一积分后的数据全部导入《中药色谱特征图谱相似度评价系统软件》（2012版），以S1批药材的图谱为参照谱图，使用中位数进行自动匹配，加以多点校正，确定13个共有色谱峰，建立吴茱萸药材的对照谱图（图2）。

图1 29批吴茱萸药材的HPLC指纹图谱Fig.1 HPLC fingerprints of 29 batches of Evodiae Fructus

图2 吴茱萸HPLC指纹图谱共有模式Fig.2 Common pattern of HPLC fingerprints of Evodiae Fructus

3.2 特征峰的确证与指认

采用HPLC-Q-TOF-MS/MS技术，通过分析化合物的保留时间、一级离子质荷比以及二级离子碎片信息，并与相关文献报道信息进行匹配，共鉴定出吴茱萸指纹图谱中13个特征峰，包括4种葡萄糖酸，1种有机酸，2种黄酮类化合物、3种吲哚喹啉类生物碱和3种喹诺酮类生物碱（表2）。为进一步研究吴茱萸的化学成分组成及阐明其药效物质基础提供参考依据。

表2 吴茱萸指纹图谱特征峰的鉴定Table 2 Identification of characteristic peaks of Evodiae Fructus fingerprint

3.3 指纹图谱相似度计算

将29批吴茱萸谱图数据导入《中药色谱特征图谱相似度评价系统软件》（2012版），计算相似度，结果见表3。29批吴茱萸药材的相似度大于0.917，不同基原的吴茱萸指纹图谱轮廓相似，但存在一定差异。其中，吴茱萸的相似度范围大于0.934；石虎吴茱萸相似度范围为0.917～0.945；疏毛吴茱萸的范围为0.920～0.952。

表3 29批吴茱萸样品的相似度分析结果Table 3 Similarity evaluation of 29 batches of Evodiae Fructus

3.4 聚类分析

为了进一步分析不同基原吴茱萸的远近关系，以吴茱萸指纹图谱中13个共有峰峰面积为变量，导入SPSS 22.0软件，采用组间均连法，选择平方欧式距离为测度对其进行系统聚类分析，结果见图3。由聚类结果可知29批样品在平方欧式距离为5～10时，29批吴茱萸药材分为3大类，不同产地不同批号的S1～S8（吴茱萸药材）聚为一类，不同批号的S9～S24（石虎）聚为一类；S25～S29批（疏毛吴茱萸）聚为一类。由此可以看出，不同基原吴茱萸药材具有较为明显的分类趋势。当平方欧式距离为10～25时，吴茱萸和石虎可以进一步聚为一类，这2种基原药材的质量概貌更为相似。

图3 吴茱萸药材聚类分析树状图Fig.3 Cluster analysis dendrogram of 29 batches of Evodiae Fructus

3.5 正交偏最小二乘判别分析（partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）

以29批不同基原吴茱萸指纹图谱中的13个共有峰峰面积为变量，将其导入SIMICA 14.0软件，进行OPLS-DA。如图4，OPLS-DA分析结果表明，吴茱萸3个基原品种样本群处于不同的空间聚落，可以实现较好地区分，说明3种基原吴茱萸的化学成分存在一定的差异。其中，石虎吴茱萸聚落更为集中紧凑，说明同一产地的石虎吴茱萸药材质量差异较小；相反，吴茱萸聚落较为分散，离散度大于疏毛吴茱萸样本，可能是由于不同产地的生长环境、气候条件造成吴茱萸药材质量差异较大。为了进一步确认对药材分组贡献较大的成分，将3种基原吴茱萸药材进行两两分组，根据变量重要性投影值（variable importance in project，VIP）筛选不同基原吴茱萸药材之间的差异性质量标志物[12-14]，结果显示，吴茱萸和石虎吴茱萸的差异性质量标志物为峰8、11、12、10；石虎吴茱萸和疏毛吴茱萸的差异性质量标志物为峰6、3、8、10、2、11；吴茱萸和疏毛吴茱萸的差异性质量标志物为峰6、3、2。

图4 OPLS-DA分析Fig.4 OPLS-DA

3.6 含量测定

3.6.1 线性关系考察 精密吸取吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢吴茱萸碱和水仙苷对照品储备液适量，配制成7个质量浓度系列的混合对照品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定，以各对照品质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程、相关系数（R2）和线性范围，结果见表4。

表4 4个指标成分线性关系和线性方程Table 4 Linear relationship and linear range of four components

3.6.2 精密度试验 取混合对照品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，记录吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢吴茱萸碱和水仙苷峰面积，并计算峰面积RSD，结果显示吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢吴茱萸碱和水仙苷的峰面积RSD值分别为0.21%、0.08%、0.29%、0.31%，表明仪器精密度良好。

3.6.3 稳定性试验 取同一供试品溶液（批号S1），在制备后的0、6、12、18、24 h分别进样，记录吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢吴茱萸碱和水仙苷的峰面积，计算各指标成分峰面积RSD为0.58%、0.01%、0.78%、1.20%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

3.6.4 重复性试验 取同一吴茱萸样品粉末6份（S1），按照“2.2.2”项下样品处理方法制备，按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定，记录吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢吴茱萸碱和水仙苷的峰面积，计算峰面积RSD分别为1.98%、1.40%、1.82%、1.92%，表明本方法重复性较好。

3.6.5 加样回收率试验 精密称取吴茱萸粉末（批号S1）6份，每份0.05 g，精密称定，置25 mL量瓶中，分别加入吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢吴茱萸碱和水仙苷对照品1.6、0.45、0.33、0.33 mg，精密加入75%甲醇适量，定容至25 mL量瓶，后续处理同“2.2.2”项。按照“2.1.1”项下色谱条件进行测定，结果显示，吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢吴茱萸碱和水仙苷的回收率分别为96.94%、92.52%、91.79%、97.76%，RSD分别为3.19%、3.04%、4.28%、3.09%。

3.6.6 样品含量测定 通过对29批吴茱萸药材进行分析，测定不同基原吴茱萸药材中吴茱萸碱、吴茱萸次碱、去氢吴茱萸碱和水仙苷含量，含量测定结果见表5。结果显示，29批吴茱萸药材中吴茱萸碱质量分数在1.10%～4.51%，吴茱萸次碱质量分数在0.21%～0.99%，去氢吴茱萸碱质量分数在0.60%～0.91%，水仙苷质量分数在0.14%～0.65%。

表5 吴茱萸中4种成分定量结果Table 5 Quantitative result of four components in Evodiae Fructus

4 讨论

4.1 柱温的选择

在相同色谱柱上，比较30、35、40、45、50 ℃5个柱温条件对同一吴茱萸样品的分离效果。结果表明，在柱温30 ℃条件下，特征图谱的整体分离效果最佳。随着柱温升高，20 min左右主要色谱峰的分离度不断减小，因此，选定吴茱萸药材特征图谱的柱温为30 ℃。

4.2 体积流量的选择

在1 mL/min条件下，吴茱萸药材特征图谱的分析时间较长（80 min），考虑到减小特征图谱分析时间，提高检测效率，考察1.5 mL/min条件下特征图谱的分离效果。结果表明，在1.5 mL/min条件下，分析时间缩短至60 min，且色谱峰的数目和分离度基本相同。因此，选定吴茱萸药材特征图谱的体积流量为1.5 mL/min。

吴茱萸具有散寒止痛、助阳止泻的功效，在治疗和预防心血管疾病、抗菌消炎、抗过敏、抗肿瘤收缩血管等方面有显著疗效，其活性成分主要包括生物碱、黄酮、有机酸等[2]。因此，比较甲醇、75%甲醇、50%甲醇、70%乙醇对吴茱萸药材的提取效果。从峰的数目和峰面积等方面综合比较色谱图发现，75%甲醇作为提取溶剂得到的样品，其色谱峰数较多，峰面积相对较高，基线平稳，较好地反映吴茱萸药材的质量概貌。综合考虑，选定75%甲醇作为吴茱萸药材特征图谱的提取溶剂。

在相同色谱条件下，比较Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Tnature C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）等2种色谱柱对同一吴茱萸样品的分离效果。结果表明，吴茱萸样品在两根不同品牌C18色谱柱上的分离效果差别较大，其中在Tnature C18色谱柱上的峰形和分离度相对较好。这主要是由于吴茱萸样品中含有吴茱萸碱和吴茱萸次碱等生物碱类化合物，而Tnature C18色谱柱表面带有一定量的正电荷，有利于生物碱类化合物的分离。综合考虑，选定吴茱萸药材特征图谱的分析色谱柱为Tnature C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

本实验对收集的29批不同基原吴茱萸药材进行了研究，建立了3种基原吴茱萸药材的定量指纹图谱，标定了13个共有峰，并通过液质联用进行峰指认，明确了吴茱萸药材的物质基础。在指纹图谱的基础上，通过聚类分析和正交偏最小二乘判别分析对3种基原吴茱萸进行了区分。结果显示：两种方法的分类效果均较为明显；OPLS-DA结果中，不同基原吴茱萸药材之间的差异性质量标志物也存在差异。此外，对吴茱萸药材中4种指标性成分同时进行测定。由定量结果可知，3种基原吴茱萸药材中，去氢吴茱萸碱的含量较为接近；石虎吴茱萸中吴茱萸碱、吴茱萸次碱和水仙苷的含量最高，其次是吴茱萸药材，疏毛吴茱萸最低。由此看出，吴茱萸各化学成分的含量与基原品种密切相关，不同基原的吴茱萸药材质量具有明显差异。本实验建立的吴茱萸定量指纹图谱简单可靠，可为吴茱萸药材质量的综合评价提供一定的参考依据。

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