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参芪扶正注射液通过调控miR-29b/Bcl-2通路逆转胰腺癌多药耐药研究

2021-07-21文柳静

中草药 2021年14期
关键词:参芪扶正胰腺癌

文柳静,张 洁

天津医科大学肿瘤医院,国家肿瘤临床医学研究中心,天津市肿瘤防治重点实验室,天津市恶性肿瘤临床医学研究中心,天津 300060

胰腺癌是一种恶性程度极高的消化道肿瘤,早期不易诊断,手术预后差[1]。2019年美国癌症协会发布的数据表明,胰腺癌5年生存率为9%,是生存率最低的肿瘤[2]。目前,化疗是治疗胰腺癌的主要手段[3]。但是,肿瘤多药耐药的发生往往导致化疗失败。中药可以逆转胰腺癌的化疗耐药,增加其敏感性[4-6]。随着生物学技术的进步,大量研究显示,微小RNA(microRNA,miRNA)通过降解mRNA或抑制翻译来调控基因表达,从而参与多种生物过程,影响肿瘤的发展、预后以及耐药[7]。miRNA在胰腺癌发生发展中发挥了重要的调节作用[8]。miRNA-155通过提高抗凋亡因子的活性产生化疗药物的耐药性,靶向miRNA-155能够有效降低肿瘤细胞耐药性[9]。过表达miRNA-145-5P能够抑制胰腺导管腺癌PDAC细胞的增殖和侵袭能力,下调B淋巴细胞瘤2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)表达,表明其与肿瘤的耐药性密切相关[10]。

本课题组前期研究结果显示[11],参芪扶正注射液能够通过下调人胰腺癌 5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)耐药细胞株Patu8988/5-Fu多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1,MDR1)和Bcl-2表达,上调Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)表达,从而逆转Patu8988/5-Fu细胞多药耐药。本研究考察参芪扶正注射液对miR-29b表达的影响以及miR-29b对Patu8988细胞增殖能力的影响,探讨Patu8988/5-Fu耐药细胞中miR-29b模拟物(miR-29bmimics)和miR-29b抑制剂(miR-29binhibitors)对Bcl-2蛋白表达的差异,为参芪扶正注射液逆转胰腺癌多药耐药的机制提供依据。

1 材料

1.1 细胞

人胰腺癌细胞株Patu8988购自南京凯基生物科技发展有限公司

1.2 药品与试剂

参芪扶正注射液(批号190934,250 mL/瓶)购自丽珠集团利民制药厂;RPMI 1640培养基(批号8117203)购自美国Gibco公司;5-Fu(批号1801091)购自天津金耀集团有限公司;特异性引物、Prime Script RT Master Mix和SYBR Premix EX Taq II购自日本 Takara公司;miR-29bmimics、miR-29binhibitors、FECT™ CP转染试剂购自广州市锐博生物科技有限公司;HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体(批号9109)购自武汉博士德生物工程有限公司;ECL超敏发光液(批号1815a01)购自北京普利莱基因技术有限公司;β-actin抗体(批号8457S)、Bcl-2抗体(批号15071)购自美国CST公司。

1.3 仪器

PCR仪购自英国CorBett公司;ImageQuant LAS 4000 mini成像系统购自美国GE公司。

2 方法

2.1 细胞培养和耐药细胞株的建立

Patu8988细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基,于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。按课题组前期方法[11]建立Patu8988/5-Fu耐药细胞株,将诱导成功的Patu8988/5-Fu细胞在含20 μg/mL 5-Fu的培养液中培养,取培养5代且处在对数生长期的细胞进行后续实验。

2.2 参芪扶正注射液对 Patu8988/5-Fu细胞miR-29b mRNA表达的影响

将处于对数生长期的Patu8988/5-FU细胞,以2×105/mL接种于6孔板,培养24 h。设置对照组和参芪扶正注射液(5、10、20 μL/mL)组,各给药组加入相应药物,对照组加入不含药物的培养基,分别培养12、24 h,收集细胞。按照试剂盒说明书提取细胞总RNA并合成cDNA,进行qRT-PCR分析。引物序列:miR-29b上游引物5’-GGTACCGGTTGTCTTGGGTTTATTG-3’,下游引物5’-GAATTCAAATACTTCAGAGCTG-3’;U6上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,下 游 引 物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

2.3 转染miR-29b mimics和miR-29b inhibitors对Patu8988/5-Fu细胞miR-29b mRNA表达的影响

将处于对数生长期的Patu8988/5-FU细胞,以2×105/mL接种于6孔板,待细胞融合度达到30%~50%时按照试剂盒说明书进行转染。miR-29bmimics引物序列5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’;miR-29binhibitors引物序列5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’。转染24 h后,按“2.2”项下方法检测Patu8988/5-FU细胞中miR-29bmRNA表达情况。

2.4 miR-29b mimics和miR-29b inhibitors对Patu8988细胞活力的影响

将处于对数生长期的Patu8988细胞,以4×104/mL接种于96孔板,培养24 h。设置对照组、miR-29bmimics组和miR-29binhibitors组,按照试剂盒说明书将miR-29bmimics和miR-29binhibitors分别转染至细胞内,培养6 d,加入MTT,采用酶标仪测定490 nm波长处吸光度(A)值。

2.5 参芪扶正注射液对Patu8988/5-Fu细胞Bcl-2蛋白表达的影响

将处于对数生长期的Patu8988/5-FU细胞,以2×105/mL接种于6孔板,培养24 h。设置对照组、mimics阴性对照(NC mimics)组、miR-29bmimics组、miR-29bmimics+参芪扶正注射液(20 μL/mL)组、抑制剂阴性对照(anti-miR-NC)组、miR-29binhibitors组、miR-29binhibitors+参芪扶正注射液(20 μL/mL)组,按照试剂盒说明书将miR-29bmimics、miR-29binhibitors及相应对照分别转染至细胞内,各给药组加入相应药物,对照组加入不含药物的培养基,培养24 h,收集细胞。加入裂解液,4 ℃、13 000 r/min离心10 min,取上清,采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度,蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转至PVDF膜,加入5%脱脂牛奶封闭2 h,分别加入Bcl-2、β-actin抗体(1∶1000),室温孵育1 h后,4 ℃孵育过夜;加入HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体(1∶200),室温孵育1 h,加入ECL超敏发光液显影,采用ImageQuant LAS软件成像。

2.6 统计学方法

数据以±s表示,采用SPSS 13.0软件中单因素方差分析(One-way ANOVA)进行统计分析。

3 结果

3.1 参芪扶正注射液对 Patu8988/5-Fu细胞miR-29b mRNA表达的影响

如图1所示,与对照组比较,参芪扶正注射液(20 μL/mL)作用于Patu8988/5-Fu细胞12 h,显著上调miR-29bmRNA表达水平(P<0.001);参芪扶正注射液(5、10、20 μL/mL)作用于Patu8988/5-Fu细胞24 h,均显著上调miR-29bmRNA表达水平(P<0.05、0.01、0.001)。

图1 参芪扶正注射液作用12 h 和24 h 对Patu8988/5-Fu细胞miR-29b mRNA表达的影响Fig.1 Effect of Shengqi Fuzheng Injection on miR-29b mRNA expression in Patu8988/5-Fu cells for 12 h or 24 h

3.2 转染miR-29b mimics和miR-29b inhibitors对Patu8988/5-Fu细胞miR-29b mRNA表达的影响

如图2所示,与NC mimics组比较,miR-29bmimics组miR-29bmRNA表达水平显著升高(P<0.001);与anti-miR-NC组比较,miR-29binhibitors组miR-29bmRNA表达水平显著降低(P<0.01)。

图2 转染miR-29b mimics (A) 和miR-29b inhibitors (B) 对Patu8988/5-Fu细胞miR-29b mRNA表达的影响Fig.2 Effect of transfection of miR-29b mimics (A) and miR-29b inhibitors (B) on miR-29b mRNA expression in Patu8988/5-Fu cells

3.3 miR-29b mimics和miR-29b inhibitors对Patu8988细胞活力的影响

如图3所示,与对照组比较,miR-29bmimics组细胞活力显著降低(P<0.05),miR-29binhibitors组细胞活力显著升高(P<0.01),表明miR-29b能够抑制Patu8988细胞增殖,具有抗肿瘤作用。

图3 miR-29b mimics和miR-29b inhibitors对Patu8988细胞活力的影响Fig.3 Effect of miR-29b mimics and miR-29b inhibitors on viability of Patu8988 cells

3.4 参芪扶正注射液对Patu8988/5-Fu细胞Bcl-2蛋白表达的影响

如图4所示,与对照组比较,miR-29bmimics组Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05),miR-29bmimics+参芪扶正注射液组Bcl-2蛋白表达进一步降低(P<0.05);miR-29binhibitors组Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P<0.05),miR-29binhibitors+参芪扶正注射液组Bcl-2蛋白表达水平无明显变化。

图4 参芪扶正注射液对Patu8988/5-Fu细胞Bcl-2蛋白表达的影响Fig.4 Effect of Shengqi Fuzheng Injection on Bcl-2 expression in Patu8988/5-Fu cells

4 讨论

参芪扶正注射液由党参和黄芪配比而成,党参多糖和黄芪中的多糖、皂苷、黄酮等成分均具有免疫调节作用。参芪扶正注射液对胰腺癌Mia-PaCa-2细胞、乳腺癌MDA-MB-231细胞、非小细胞肺癌细胞等多种肿瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用,并能够有效逆转多药耐药,其作用机制与调控多种相关基因、蛋白有关[12-15]。

miRNA是一类调控性的小分子非编码RNA,通过与靶基因mRNA的3’非编码区结合调控基因表达。miRNA参与肿瘤的多种生物学和生理过程[16-17]。miR-29b作为miRNA中的重要一员,发挥了重要的抑癌作用[18]。miR-29b具有调控多种下游信号通路和靶基因的作用[19-20]。miR-29b的靶基因是促凋亡因子Bcl-2修饰因子(Bcl-2 modifying factor,BMF),miR-29bmimics可以显著降低BMF基因和蛋白表达水平[21]。过表达人单核白细胞系THP-1中miR-29b能够显著抑制细胞增殖,并诱导细胞凋亡[22]。miR-29b能够抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖和迁移,Rhotekin蛋白(recombinant rhotekin,RTKN)可能是miR-29b调控乳腺癌细胞生物学行为的新靶点[23]。埃布尔森小鼠白血病病毒癌基因1(abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1,ABL1)和断裂点簇集区(breakpoint cluster region,BCR)是miR-29b的靶点,过表达红白血病K562细胞中miR-29b能够抑制细胞生长和集落形成能力,从而诱导细胞凋亡[24]。纹蛋白4(striatin 4,STRN4)是miR-29b的靶点,下调miR-29b可以提高非小细胞肺癌NSCLC细胞中STRN4表达水平,调控miR-29b/STRN4通道可以抑制细胞增殖并延缓肿瘤扩散[25]。miR-29b在非小细胞肺癌患者癌组织中表达水平显著降低,过表达miR-29b可以抑制肺癌A549细胞增殖,可能为肺癌靶向药物研发的一个新靶点[26]。

Bcl-2是重要的抗凋亡基因,与多种肿瘤的发生发展相关。上调Bcl-2/Bax可以抑制化疗药物引起的细胞凋亡,进而参与肿瘤细胞化疗耐药性的形成[27]。研究表明,miR-29b不仅参与细胞增殖和诱导细胞凋亡,而且通过调控Bcl-2表达水平或Bcl-2/Bax,逆转肿瘤多药耐药[28-29];miR-29b可以通过下调Bcl-2表达水平促进肿瘤细胞凋亡[30];LINC00511通过miR-29b下调Bcl-2表达水平并上调Bax表达水平,抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭,逆转宫颈癌对紫杉醇的耐药性[31]。本研究结果显示,miR-29bmimics组Patu8988细胞活力显著降低,miR-29binhibitors组Patu8988细胞活力显著升高,表明miR-29b可以抑制Patu8988细胞增殖;参芪扶正注射液显著上调Patu8988/5-Fu细胞miR-29bmRNA表达,miR-29bmimics显著降低Bcl-2蛋白表达水平,miR-29binhibitors显著升高Bcl-2蛋白表达水平,miR-29bmimics+参芪扶正注射液组Bcl-2蛋白表达水平进一步降低。结合前期研究结果,参芪扶正注射液可以逆转Patu8988/ 5-Fu细胞的耐药性[11],表明参芪扶正注射液通过调控miR-29b和Bcl-2表达,抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡,增加Patu8988/5-Fu细胞对化疗药物的敏感性,从而逆转肿瘤多药耐药。

综上所述,参芪扶正注射液可能通过调控miR-29b/Bcl-2通路从而逆转肿瘤多药耐药。miR-29b可能是参芪扶正注射液调控Patu8988/5-Fu耐药细胞Bcl-2表达的靶点,为深入研究参芪扶正注射液逆转胰腺癌MDR的作用机制提供参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

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