槐耳抗肿瘤活性部位筛选研究

黄 挺 杨 翀 徐志远 程向东

槐耳是多孔菌科真菌槐栓菌Trametes robiniophila Murr.的干燥子实体，别名槐檽、槐菌、槐鸡、槐蛾、赤鸡等，主要分布于我国陕西、山东、河北等地[2]。临床和基础实验证实，槐耳具有良好的抗肿瘤作用，对肿瘤的生长、增殖、侵袭与转移均具有抑制作用，能诱导恶性肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成，逆转耐药细胞株，增强化疗药物敏感性等疗效明显，且对正常细胞毒性小[1-8]。本研究主要探讨槐耳不同提取物对不同肿瘤细胞的体外抑制作用，报道如下。

1 实验材料

1.1 细胞株 人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549、人胰腺癌细胞PANC-1、人肠癌细胞HCT-116、人胃癌细胞MKN-45、人胃癌细胞BGC-823 细胞株，均来源于中国科学院生命科学研究院细胞库。

1.2 药品与试剂 槐耳药材（浙江佐力百草中药饮片有限公司，产于山东，批号20151001）经浙江中医药大学中药资源与鉴定教研室陈孔荣教授鉴定，来源于山东，为多孔菌科真菌槐栓菌Trametes robiniophila Murr.的干燥子实体；槐耳颗粒（启动盖天力药业有限公司，批号EJ14）；RPMI Medium Modified 1640（美国HyClone 公司，批号1676918）；胎牛血清FBS（Gibco，批号1616966）；胰蛋白酶-EDTA 消化液（美国Gibco 公司，批号21467 E16）；Cell Counting Kit-8（杭州诺扬生物有限公司，批号010417170406）；Phosphate Buffered Saline（美国HyCloneTM公司，批号NAH1449）；DMSO（Dimethyl Sulfoxide）（美 国Sigma-Aldrich 公司，批号WXBB8079V）。

1.3 主要仪器 十万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，型号XS105）；千分之一电子天平（常州市幸运电子设备有限公司，型号JA203H）；百分之一天平（常州市幸运电子设备有限公司，型号XY2000C）；台式冷冻多用离心机（Thermo Electron Corporation，型号CL31R）；超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司，型号KQ5200DE）；超低温冰箱（Thermo Electron Corporation）；多 功 能 酶 标 仪（Thermo scientific，型号Varioskan Flash）；CO2细胞培养箱（Thermo Electron Corporation，型号3111）；倒置荧光显微镜（日本Nikon 公司，OLYMPUS CKX41SF）；生物安全柜（Thermo，型号1287）。

2 实验方法

2.1 样品制备 采用系统溶剂法依次、分段制样，称取干燥的槐耳子实体粉末10g，加入10 倍量石油醚加热回流2 次，每次1h，提取液浓缩得到样品A（槐耳石油醚浸膏）；提取后药渣经减压浓缩，除去石油醚干燥后加入30 倍量90%乙醇，加热回流2 次，每次2h，浓缩得到醇提液，浓缩得到样品B（槐耳醇提浸膏）；醇提后药渣经干燥，除去乙醇，加入20 倍量蒸馏水回流3 次，每次2h，得到水提液，浓缩得到样品C（槐耳水提浸膏）。

2.2 细胞培养 将冷冻保存的6 种人肿瘤细胞株复苏后，HepG2、PANC-1 培养于含10%优质胎牛血清的DMEM 培养液，A549、HCT-116、MKN-45、BGC-823 细胞株均培养于含10%优质胎牛血清的RPMI-1640 培养液，37℃、5%CO2培养箱中生长至80%细胞融合，取对数生长期细胞用于实验。

2.3 体外抗肿瘤实验及提取物再分离 采用CCK-8 法测定不同浓度梯度（16、8、4、2、1、0.5、0.25mg/mL）的槐耳各提取物（A、B、C、B+C、A+B+C）对各种人肿瘤细胞增殖抑制作用。根据细胞实验结果，进而对槐耳乙醇提取物，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶剂后，得到石油醚部位、三氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位。CCK-8 法观察不同槐耳提取部位对人胃癌BGC-823 细胞增殖的影响。

2.4 肿瘤细胞处理 人胃癌BGC-823 细胞培养于含10%优质胎牛血清的RPMI-1640 培养液，37℃、5%CO2培养箱中生长至80%细胞融合，用0.1%胰酶溶液消化，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/mL，均匀接种于96 孔微量培养板中，每组3 个复孔，100μL/孔，置37℃饱和湿度、5%CO2孵箱内培养24h 后，正常对照组加入含等量的培养液；加入浓度梯度的药物，每100μL/孔，平行设5 个复孔，同时设置不添加细胞悬液为空白对照组，只加100μL 新鲜培养基，平行测定3 次。在同样条件的培养箱内继续培养24h，每孔加入10μL CCK-8 溶液，继续孵育2h后停止培养，于多功能酶标仪上450nm 处测定各孔的光密度（OD）值，以正常对照组测得的OD 值为对照，按照抑制率公式计算槐耳各提取物组对于肿瘤细胞增殖的抑制效果，计算出IC50 值。抑制率=[1-（实验组CCK-8 检测OD 值-空白组OD）/（对照组CCK-8 检测OD 值-空白组OD）]×100%。

2.5 统计学方法 应用SPSS 22.0 统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（）表示，两组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 槐耳不同提取物体外抗肿瘤结果 槐耳各提取物对6 种肿瘤细胞增殖抑制实验均显示48h 药效较24h 药效更佳。24h 细胞药效实验结果显示，醇提和石油醚提取部位对胃癌细胞BGC-823 药效最佳；水提、醇水双提、石油醚+醇提+水提部位均表现出对肠癌细胞HCT-116 药效最佳。48h 细胞药效实验结果显示，水提和石油醚提取部位对胃癌细胞BGC-823药效最佳；醇水双提、石油醚+醇提+水提部位均表现出对肠癌细胞HCT-116 药效最佳；醇提部位对肝癌HepG2 细胞药效最佳。综合分析得出槐耳各提取物均对胃癌细胞BGC-823 具有较好的抑制增殖作用，醇水双提与石油醚+醇提+水提不存在显著性差异。见表1。

表1 槐耳不同提取物对不同肿瘤细胞的增殖抑制作用（μg/mL，）

表1 槐耳不同提取物对不同肿瘤细胞的增殖抑制作用（μg/mL，）

注：A549 人非小细胞肺癌细胞系；HepG2 为人肝癌细胞；MKN-45 为人胃癌细胞；PANC-1 为人胰腺癌细胞；HCT-116 为人结肠癌细胞；BGC-823 为人胃腺癌细胞（低分化）；与24h 比较，aP＜0.05；与24h 水提、醇水双提、石油醚+醇+水提比较，bP＜0.05；与24h 石油醚提、醇提比较，cP＜0.05；与48h 醇提、醇水双提、石油醚+醇+水提比较，dP＜0.05；与48h 石油醚提、醇提、水提、石油醚+醇+水提比较，eP＜0.05；与48h 石油醚提、水提、醇水双提、石油醚+醇+水提比较，fP＜0.05

3.2 槐耳醇提取物活性部位对BGC-823 细胞增殖抑制的结果 槐耳乙醇提取物对BGC-823 细胞的增殖抑制作用较石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取纯化组药效更佳（IC50 值最小）（P 均<0.01）；作用时间48h 较24h 效果好（P 均<0.01）。见表2。

表2 槐耳醇提取物活性部位对BGC-823 细胞增殖抑制IC50 值（mg/mL，）

表2 槐耳醇提取物活性部位对BGC-823 细胞增殖抑制IC50 值（mg/mL，）

注：BGC-823 为人胃腺癌细胞（低分化）；与24、48h 石油醚萃取、氯仿萃取、乙酸乙酯萃取、正丁醇萃取比较，aP<0.01；与24h 比较，bP<0.01

4 讨论

近年来，国内外对中药槐耳的研究集中在其水提取物上，即槐耳清膏与槐耳颗粒。2018 年《GUT》刊发了一项由我国39 家医院共同开展的多中心随机双盲Ⅲ期肝癌临床研究数据，结果提示槐耳可以降低肿瘤术后复发率、延长无复发生存期（RFS）[9]。另一项临床研究表明，口服槐耳颗粒的乳腺癌患者可获得更长的无病生存期，同时降低乳腺癌患者的血清肿瘤标志物水平，提高患者生存质量[10]。

乙醇作为中药的提取溶剂具有提取率高，回收简便等特点，但乙醇对多糖等大极性化合物的提取能力较弱。因此，本实验研究槐耳醇提物各部位的同时补充水提多糖部位的研究，以保证全面且充分的开展槐耳提取物抗肿瘤的研究。槐耳不同提取物对多种肿瘤细胞具有增殖抑制作用，且对BGC-823 细胞具有最佳增殖抑制作用，BGC-823 细胞显示作用时间48h 较24h 效果好，槐耳醇水双提提取物IC50值最小，其次是醇提物，不同浸出部位之间有显著差异。因此，选择筛选出槐耳抗肿瘤活性最强的是醇水双提提取物。而此前相关研究仅限于对槐耳水提物及其多糖成分，并未对槐耳的醇提部位进行成分分析，致使相关药用部位被摒弃。

从槐耳各提取物对人胃癌BGC-823 细胞的增殖抑制试验中，我们发现与醇提组作比较，萃取处理后的醇提物较醇提物抗肿瘤效果没有增加，反而有下降趋势，可能原因是萃取处理后虽然总黄酮、总三萜纯度增加，但真正起抗肿瘤作用的不只总黄酮、总三萜成分，或者萃取处理后药材整体性遭到破坏，抗肿瘤成分之间的协同作用遭到破坏。目前槐耳醇提有效部位的具体成分还需进一步挖掘和鉴定，各成分之间是否存在协同作用需在后续实验中得到证实。因此，后续实验拟对槐耳醇提取物中的有效成分进一步分析，并为研究槐耳醇提取物有效单体成分抗肿瘤机制的研究奠定基础。