性类固醇激素在虾夷扇贝成体组织中的分布

郭振义，谢欣冉，李亚娟，刘亮洁，张丽靖，吴绍轩，张玲玲,2,王 师

( 1.中国海洋大学，海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室，山东 青岛 2660003；2.青岛海洋科学与技术试点国家实验室，海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东 青岛 266237 )

类固醇是一类具有甾核和生物活性的小分子亲脂性化合物，其在性别分化、生殖、发育过程中发挥重要作用[1-7]。孕酮、睾酮和雌二醇是3种主要的与动物生殖调控相关的性类固醇激素。在脊椎动物中，它们是以胆固醇为前体，由脱氢酶和细胞色素P450酶通过一系列催化羟基化和脱羟基氧化反应合成的[8]。软体动物也存在性类固醇激素，已有报道通过高效液相色谱法、气相色谱—质谱联用技术等方法在双壳纲、腹足纲动物体内检测到了孕酮、睾酮、雌二醇等的存在[9-12]。同时研究显示，性类固醇激素参与紫贻贝(Mytilusgalloprovincialis)[6]、砂海螂(Myaarenaria)[13]等的生殖调控。但关于性类固醇激素在软体动物中是否存在合成、转化、运输等过程，目前所知甚少。

虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)是一种双壳类软体动物，在中国、韩国、日本、俄罗斯萨哈林岛均有分布，已在东北亚形成规模化养殖。自2000年以来，虾夷扇贝全球年产值已超过15亿美元。鉴于虾夷扇贝在水产养殖业中的重要地位，目前已有大量关于虾夷扇贝性腺发育、繁殖规律的研究报道[14-17]。谢欣冉等[18]发现，虾夷扇贝精巢和卵巢中的孕酮、睾酮和雌二醇含量变化随性腺发育呈现出一定的规律，推测其在配子发生过程中发挥重要作用。笔者分析虾夷扇贝7个成体组织中3种常见的性类固醇激素(孕酮、睾酮和雌二醇)的含量分布，以期为理解性类固醇激素在软体动物中的合成与转化过程提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2龄虾夷扇贝于2015年2月和10月取自山东省莱州市海益养殖厂，运回实验室后置于过滤海水中暂养24 h。每次挑选40个活力良好的样品(雌雄各20个)，手术刀割开虾夷扇贝闭壳肌，用去掉针头的无菌1 mL注射器，自闭壳肌割裂处吸取血淋巴，4 ℃放置1 h后，3000 r/min离心10 min，吸取上清液，以备激素测定。同时，取适量的肾、肝胰腺、鳃、外套膜、闭壳肌和性腺，用吸水纸吸干组织块表面海水后，于液氮中快速冷冻，保存于-80 ℃，用于激素提取。

1.2 性类固醇激素提取

采用二氯甲烷液液萃取法进行激素提取，步骤如下：取0.1 g上述组织样品，用预冷的0.5 mL超纯水匀浆2次，每次2 min；使用超声波细胞破碎仪将组织匀浆破碎(200 W,超声10 s，暂停5 s，共3 min)；加入400 μL预热的HCl(25 mmol/L),涡旋2 min，之后40 ℃水浴孵育15 min；孵育结束后，加入1.25 mL Na2HPO4(0.07 mol/L)，向匀浆液中加入14 mL二氯甲烷，涡旋2 min，之后将匀浆液于6000 r/min离心10 min，使水与有机相分离，使用巴斯德管将下层有机相转移至50 mL离心管中；向残留有上层无机相的离心管中再次加入14 mL二氯甲烷，涡旋2 min，之后6000 r/min离心10 min，使用巴斯德管将下层有机相转移至50 mL离心管中；使用氮吹仪在室温将有机相中二氯甲烷吹干获得的固态残留物，用500 μL激素测定试剂盒中的EIA buffer溶解。

1.3 性类固醇激素测定

用美国Cayman公司的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒测定虾夷扇贝各成体组织中孕酮、睾酮和雌二醇的含量，流程参照试剂盒中的说明书。每个样品设2个技术重复，用Cayman公司提供的ELISA Double表格计算样品中的激素含量。类固醇含量定义为每克湿质量的类固醇质量(ng/g)。

1.4 数据统计分析

虾夷扇贝不同组织中性激素的差异显著性采用单因素方差分析法分析；雌雄个体的各组织中性激素的差异显著性使用独立样本t检验分析；将所测得的3种激素含量进行以2为底的对数转换，通过Pearson相关分析法分析3种激素的相关性。显著性水平均设定为0.05。以上分析均使用SPSS 21.0软件计算。

2 结 果

2.1 成体各组织中3种性类固醇激素的含量分布

在虾夷扇贝成体各组织中，孕酮的含量为2.09～13.94 ng/g，其中血淋巴的孕酮含量远远高于其他各成体组织，其次为肝胰腺，闭壳肌中含量最低；睾酮的含量为0.29～2.51 ng/g，血淋巴中含量最高，其次为肾、肝胰腺和性腺，闭壳肌中含量最低；各组织中雌二醇的含量为0.96～8.01 ng/g，血淋巴中含量最高，其次为肾和性腺，肝胰腺中含量最低。3种激素总含量在不同成体组织中的变化为3.27～24.45 ng/g，血淋巴中含量最高，闭壳肌中含量最低。

分析孕酮、睾酮、雌二醇相对于性类固醇激素的百分比，在扇贝大部分组织中，上述3种激素分别约占性类固醇激素总含量的60%、10%和30%，但在肝胰腺中孕酮占比高达80%(图1)。

分析孕酮、睾酮和雌二醇含量之间的相关性(图2)。在虾夷扇贝个体中，3种激素含量均呈显著正相关：孕酮与睾酮的相关性最高(r=0.89，P<0.01)、其次是雌二醇与睾酮(r=0.83，P<0.01)、孕酮与雌二醇的相关系数稍低(r=0.70，P<0.01)。

图2 虾夷扇贝成体各组织中3种性类固醇激素之间的相关性Fig.2 Correlation among the three sex steroids in the adult tissues of Yesso scallop P. yessoensis

2.2 性类固醇激素组织分布的雌雄差异

分析性类固醇激素在雌、雄个体不同组织间的差异(图3)。雄性个体的血淋巴、肝胰腺和闭壳肌中孕酮含量显著高于雌性个体(P<0.05)，肝胰腺中的差异最大，闭壳肌中的差异较小(图3a)；在所有成体组织中，雄性个体所含睾酮量均高于雌性个体，并且在血淋巴、鳃、外套膜、肝胰腺和闭壳肌中呈现显著差异(P<0.05)(图3b)；在血淋巴和闭壳肌中，雄性个体的雌二醇含量显著高于雌性个体(P<0.05)，其他组织中雌雄差异不显著(图3c)。

图3 性类固醇激素在虾夷扇贝雌、雄个体各组织中的含量Fig.3 Sex steroid concentrations in the tissues of male and female Yesso scallop P. yessoensis所有数据均表示为平均值±标准误 (n=3);*表示雌性个体和雄性个体间存在显著差异(P<0.05)；下同.Each value is represented as mean±SE (n=3); * indicates significant differences between male and female (P<0.05)； et sequentia.

孕酮、睾酮、雌二醇相对于性类固醇激素总含量的百分比在雌雄个体间的差异大多不显著，但存在一定规律：除肝胰腺外，雌性个体的孕酮比例均略高于雄性个体；在所有检测的组织中，雄性个体的睾酮占比均高于雌性个体，在外套膜中差异显著(P<0.05)；在大部分组织中，雄性个体的雌二醇占比高于雌性个体，但是在肝胰腺和性腺中则相反，雌性个体的雌二醇占比高于雄性个体。

进一步探究了各成体组织中睾酮/孕酮、雌二醇/睾酮和雌二醇/孕酮在雌、雄个体间的差异(图4)。雄性个体各成体组织中睾酮/孕酮均高于雌性个体，在鳃和外套膜中差异显著(P<0.05)(图4a)。雌二醇/睾酮在除鳃以外的组织中均是雌性个体高于雄性个体，在肝胰腺和性腺中差异显著(P<0.05)，雌性的值分别为雄性的1.77和1.83倍(图4b)。雌二醇/孕酮在大部分成体组织中呈现雄性个体高于雌性个体，但仅在鳃中差异显著(P<0.05)(图4c)。

图4 睾酮/孕酮、雌二醇/睾酮和雌二醇/孕酮比值在虾夷扇贝雌、雄个体各组织中的水平Fig.4 The levels of testosterone/progesterone, estradiol/testosterone and estradiol/progesterone in the adult tissues of male and female Yesso scallop P. yessoensis

3 讨 论

3.1 不同物种成体组织中性激素水平的差异

ELISA试剂盒法是目前软体动物性类固醇激素含量检测最常用的方法，已被广泛应用于贻贝[19]、牡蛎[20]、扇贝[21]、蛤[22]等的性激素测定。笔者采用ELISA试剂盒检测了虾夷扇贝各成体组织中孕酮、睾酮和雌二醇的含量，其中血淋巴中雌二醇的平均含量为8.01 ng/g、睾酮含量为2.51 ng/g、孕酮含量为13.94 ng/g。与菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[23]和中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)[24]血淋巴中的激素含量相比，虾夷扇贝血淋巴中性类固醇激素的含量要高于二者。

虾夷扇贝肝胰腺中雌二醇的平均含量为0.96 ng/g、睾酮含量为0.82 ng/g、孕酮含量为7.13 ng/g；在中国明对虾的肝胰腺中，孕酮平均含量为0.90 ng/g，雌二醇含量为0.22 ng/g[24]。可见孕酮含量高于雌二醇，这在虾夷扇贝和中国明对虾中均存在，并且虾夷扇贝肝胰腺中的性类固醇激素含量稍高于中国明对虾。

3.2 软体动物性类固醇激素的合成与转化

已有研究报道，软体动物可以从环境中吸收孕酮[25]，并在肝胰腺(有时称为“消化腺”)进一步代谢[26]。本试验中也发现，虾夷扇贝肝胰腺中孕酮含量占性类固醇激素总含量的比例显著高于其他组织，支持肝胰腺可能是合成或吸收孕酮的场所。同时研究显示，虾夷扇贝血淋巴中3种性类固醇激素的含量均远远高于其他成体组织，提示性类固醇激素可能在血淋巴中积累，并运送至其他组织。

在脊椎动物中存在着孕酮转化为睾酮，睾酮再通过芳香化酶的作用转化为雌二醇的过程[27]。本试验结果显示，虾夷扇贝的3种激素(孕酮、睾酮和雌二醇)含量之间均呈显著正相关，表明虾夷扇贝可能存在着类似于脊椎动物3种激素的转化过程。在双壳类中，孕酮也被认为是雌雄激素的前体，在生殖周期中起重要调节作用[28]。此外，研究者在多种软体动物中均检测到了3种激素转化过程相关酶的活性：在Aplysiadepilans中检测到了3β-羟基类固醇脱氢酶复合物活性[29]，在Ruditapesdecussata和紫贻贝中检测到5α-还原酶活性[30-31]，在大羊角螺(Marisacornuarietis)中检测到17β-羟基类固醇脱氢酶活性[32]。近期研究显示，虾夷扇贝体内存在较为完整的性激素合成通路，提示虾夷扇贝具有合成孕酮、睾酮等激素的能力[33]。综上所述，软体动物中可能存在着类似于脊椎动物性类固醇激素的合成过程。

尽管负责脊椎动物雌二醇转化的芳香化酶编码基因Cyp19A仅在脊椎动物中发现，但本试验结果显示，雌二醇/睾酮在虾夷扇贝雌雄性腺之间具有较大差异，提示扇贝性腺中存在雌二醇转化相关酶。这与谢欣冉等[18]的观点一致，即虾夷扇贝和栉孔扇贝(Chlamysfarreri)性腺可能都具有催化睾酮向雌二醇转化的能力。此外近期的同位素试验也证实，Mytilustrossulus[34]体内存在将雄激素转化为雌激素的酶，且卵巢中的芳香化效率高于精巢。由此可见，芳香化酶活性可能广泛存在于双壳类动物，该类群动物具有体内合成雌激素的能力。

4 结 论

通过酶联免疫吸附法检测了虾夷扇贝成体各组织中孕酮、睾酮和雌二醇的含量，初步推测孕酮可在扇贝肝胰腺中合成或吸收；此外，3种激素均在血淋巴中积累，并可能存在类似脊椎动物的孕酮→睾酮→雌二醇转化过程。负责睾酮转化为雌二醇的芳香化酶编码基因Cyp19A虽然仅存于脊椎动物，但由于虾夷扇贝卵巢中雌二醇/睾酮高于精巢，这为软体动物中芳香化酶活性的存在提供了证据。本试验结果将有助于深入理解软体动物性类固醇激素的合成与转化过程。