土霉素原料药中N-亚硝基二甲胺杂质检查方法的分析探讨
2021-07-21郝丽霞陈倩倩
郝丽霞，智 越，陈倩倩，李 惠
(巴彦淖尔市产品质量计量检测中心,内蒙古 巴彦淖尔 015000)
N-亚硝基二甲胺(C2H6N2O,NDMA)是亚硝胺类化合物的一种,在环境中广泛存在。经消化道、呼吸道吸收迅速,经皮肤吸收缓慢。经现代研究证实,被认定为具有遗传毒性的物质,明确列入世界卫生组织国际癌症研究机构在2017年10月27日公布的致癌物清单中[1-2]。基因毒性杂质在痕量即可引起细胞产生基因突变或体内诱变。NDMA几乎可以引发人体所有脏器肿瘤, 靶器官主要为肝和肾。关于NDMA,最早引起轰动的是2013的“复旦大学投毒案”；2018年又一次进入医药行业的视野,是因为国家药监局通报华海药业缬沙坦原料药中存在NDMA残留,也由此,业界更加关注NDMA杂质的检测和分析。NDMA可由二甲胺与亚硝酸盐在酸性条件下反应而生成。二甲胺和亚硝酸都是常用的制药原料,生产过程中如果出现吻合条件,就有可能在终端产品中形成残留,因此,建立准确可靠的检验方法,考查评价产品质量是保证药品安全有效的手段。
土霉素是四环素类抗生素,为广谱抑菌剂,许多立克次体属、支原体、衣原体等微生物对该品敏感,在上个世纪六七十年代,土霉素在临床用药中占有举足轻重的地位。随着医药技术的进步,更多抗生素药物被研制成功,替代品推陈出新。土霉素生产过程包括发酵、酸化过滤、脱色结晶、离心干燥等环节,各环节所用培养基、酸化剂等工艺辅料以及环境,都有可能潜在痕量的NDMA。目前,获得国家药品监管部门批准的土霉素原料药和制剂文号仍然保存有700余个,尤其是原料药的出口有更严格要求,因此,对于该品种质量评价的研究依然重要。
1 材料与试验条件
1.1 仪器与试剂试药
7890B气相色谱仪；7010质谱仪；LPD2500多管旋涡；OM-INNOWAXms色谱柱(30mm×0.25mm×0.25μm)；HC-3018R高速冷冻离心机；氦气和氮气(纯度99.999%)；N-亚硝基二甲胺标准溶液(批号：S070533,规格1000μg/mL)；乙腈(批号：20210222,纯度99.9%)。
1.2 气相色谱条件
色谱柱：OM-INNOWAXms色谱柱(30mm×0.25mm,0.25μm)；程序升温：初始柱温为40℃,保持0.5分钟,以每分钟20℃的速率升温至200℃；再以每分钟60℃速率升温至240℃,保持5分钟；进样口温度250℃；进样体积1.0μL；进样模式：不分流进样,不分流时间0.75min；恒压模式,压力7.0699psi。
1.3 质谱条件
离子源：电子轰击离子源(EI)电压为70eV；传输线温度：250℃；离子源温度：250℃；碰撞气：氮气；增益因子：1；溶剂延迟2.5min；检测模式：MRM；定量离子对：74.1→44.1；碰撞能：6V；定性离子对：74.1→42.1,碰撞能量：17V。
2 对照溶液与供试溶液制备
2.1 对照溶液制备
精密量取N-亚硝基二甲胺标准溶液适量,用乙腈稀释定容制成1000ng/mL的溶液,作为标准储备溶液。取上述标准储备溶液适量,用乙腈逐级稀释制得系列标准曲线溶液,浓度依次为5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、200.0ng/mL；(试验中用二氯甲烷作为首选溶剂,因出峰不稳定,故调整为乙腈)
2.2 供试溶液制备
精密称取原料药约500mg,置50mL具盖离心管中,精密加入乙腈5.0mL,旋涡5min,以5000r/min(4℃)离心5min,取上清液适量,以0.45μm滤膜过滤,取续滤液,作为供试品溶液。
3 测定方法
分别取对照品系列溶液和供试品溶液进样测定,记录谱图。
4 验证试验
4.1 专属性试验
分别对乙腈溶剂空白、N-亚硝基二甲胺标准溶液及供试品溶液进行测定,记录谱图,结果显示专属性良好。详见图1～图3。
图1 乙腈溶剂空白谱图
图2 N-亚硝基二甲胺标准溶液谱图
图3 供试品溶液谱图
4.2 线性范围
对系列标准曲线溶液分别进行测定,记录谱图。以浓度(x)为横坐标对定量离子峰面积(y)为纵坐标进行绘制标准曲线,结果表明,N-亚硝基二甲胺在5.0～200ng/mL范围内线性关系良好,相关系数r2为0.9997,线性关系良好。详见图4。
图4 线性关系
4.3 仪器检出限和定量限
根据标准曲线中系列标准溶液来分别计算N-亚硝基二甲胺的仪器检出限和定量限浓度,检出限为0.2722 ng/mL,定量限为0.9073 ng/mL。见表1。
表1 检出限和定量限
4.4 重复性试验
分别精密称取原料药约500mg共六份,分别精密量取加入标准溶液(1000 ng/mL)0.25mL,制成浓度为0.50mg/kg的平行六份进行测定,结果显示N-亚硝基二甲胺的重复性及精密度试验RSD值为1.97%。见表2。
表2 重复性试验结果
4.5 回收率试验
分别精密称取原料药约500mg共九份,分别精密加入标准溶液适量,制成3个浓度(0.10、0.25和1.00mg/kg)各三份,进行测定。结果显示N-亚硝基二甲胺的平均回收率为112%,回收率RSD值为2.64%,方法准确定较高。见表3。
表3 回收率试验结果
4.6 方法检出限
根据验证准确度的回收率试验中,制备的最低加标浓度点的信噪比,计算得到方法检出限,方法检出限LOD(mg/kg)均值：0.0298 mg/kg。
5 结果判断
以子离子对的m/z和色谱图中的保留时间进行定性；同时按标准曲线法,以定量离子的峰面积计算含量。分别对不同生产企业的6批土霉素原料药进行测定,结果显示均未检出N-亚硝基二甲胺。
6 结论
通过以上检测数据,可见,采用GC-MS/MS法测定土霉素原料药中N-亚硝基二甲胺化合物的测定,方法学验证结果表明,方法操作简便,结果准确,具有良好的应用前景,有助于原料监管要求和保障质量安全。
