基于HS-SPME-Arrow-GC-MS和化学计量学的小曲清香型原酒等级判别

樊杉杉,唐洁,乐细选,杨强,刘源才,陈双,徐岩,范文来*,陈申习*

1(江南大学 生物工程学院,江苏 无锡,214122)2(酿造微生物与应用酶学实验室(江南大学),江苏 无锡,214122) 3(工业生物技术教育部重点实验室(江南大学),江苏 无锡,214122)4(劲牌有限公司,湖北 大冶,435100)5(劲牌有限公司 劲牌研究院,湖北 大冶,435100)

白酒是我国独具民族特色的蒸馏酒,其酿造过程采用微生物混菌发酵、固态发酵、固态蒸馏的方式进行[1]。独特的酿造过程一方面赋予了白酒复杂的风味特征；另一方面也造成酿造原酒风味质量的波动。为了科学管理原酒入库,保障产品质量稳定,白酒生产企业需对新酿造的原酒进行分级管理[2]。

目前生产上原酒的分级主要依靠感官品评或辅以总酸、总酯以及骨架成分含量进行判定[3]。感官品评具有快速准确的特点,但主观性强,受个体差异和环境等影响,评价结果不稳定,且评价结果多为文字性描述,难以对不同等级的差异进行量化。而白酒风味主要由除乙醇、水之外的微量成分决定[4],虽然目前骨架成分含量已纳入原酒质量评价体系,但单独依靠这些依旧无法准确区分原酒品质[5]。因此提高原酒质量等级评定的客观性和有效性是中国白酒业一个亟待解决的技术问题。

全面解析食品组分化学信息是准确判定质量的基础。近年来,国内外逐渐采用仪器分析结合化学计量学的方式进行食品质量判定[6-8],常用的仪器分析技术包括色谱[4]、质谱[9]、光谱[10]、电子传感技术[11]等。其中气相色谱结合质谱法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)具有较高的分离能力和对未知化合物的鉴定能力,目前被广泛应用于酒类饮料的掺假识别[12]、年份酒鉴定[13]等。在酒类饮料分析中样品前处理手段的选择是决定GC-MS分析数据质量的重要因素[14]。顶空固相微萃取技术(head space-solid phase microextraction,HS-SPME)因其具有选择性高、灵敏度高、无需溶剂、样品量低及检测快速的特点,是食品挥发性组分分析的最常用技术[15]。但近年来的应用实践发现,SPME萃取头吸附容量不足很大程度上限制了对样品中微量组分的分析效果[16]。针对这一问题,最近开发出的SPME Arrow萃取头提高了萃取涂层的厚度[19],萃取体积比传统SPME高24倍,更有利于样品中微量组分的分离提取。利用HS-SPME-Arrow结合GC-MS可以较为全面地对白酒中的微量挥发性组分进行定性和定量分析。随着分析方法的发展,我们可以获得大量的分析数据,化学计量学作为一种通过处理多元数据集并从中提取有用信息的方法，是一种处理数据的有效手段,目前已成功应用于食品分析研究[17-18]。将不同等级原酒中的微量组分含量进行适当的化学计量学分析,预期可以提取出原酒等级区分的更多有效信息,进而构建准确判别模型。

本研究以不同等级的小曲清香型原酒为例,全面解析挥发性组分及含量,分析了不同等级原酒挥发性组分间的差异,利用其组分含量差异特征,构建了准确判别原酒等级的模型,以期为白酒品质等级评价标准化科学化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 仪器

GC 7890B-MSD 5975气相色谱质谱联用仪、CTC多功能自动进样器、Millipore-Q超纯水系统。

1.1.2 试剂

无水乙醇(色谱纯),上海安谱科学仪器公司；C6～C30正构烷烃标准品、化合物定性及定量时所用标准品,均为色谱纯,Sigma-Aldrich 公司；NaCl(分析纯),上海国药集团。实验用水均为煮沸 5 min 后冷却至室温的超纯水。

1.1.3 实验材料

本研究所用68个不同等级小曲清香型白酒原酒样品由劲牌有限公司提供,采用机械化新工艺生产,酒精度为63%～65%(体积分数),生产时间为2020年。

1.2 试验方法

1.2.1 小曲清香型原酒等级评定

组织7位具备国家二级品酒师以上资格的专业评酒员进行原酒样品香气品质的分级,每个品酒员保持相对独立的条件下,对各个白酒样品进行等级评价。

1.2.2 小曲清香型原酒挥发性组分解析

HS-SPME-Arrow提取样品中挥发性组分：称取1.5 g NaCl,准确量取5 mL使用超纯水稀释至10%(体积分数)的酒样于顶空瓶中,用带PTFE/蓝色硅胶隔垫的空心磁性金属盖密封。使用CTC公司多功能自动进样系统(PAL)进行顶空固相微萃取。萃取过程如下：采用120 μm DVB/CAR/PDMS三相Arrow萃取头,萃取温度50 ℃,样品平衡时间5 min,萃取时间50 min,乳化器转速500 r/min。萃取结束后将萃取头置于GC进样口在250 ℃下解吸附5 min,进行GC-MS检测分析。

GC条件：进样口与检测器温度均为250 ℃,载气为高纯He,流速为1 mL/min,进样模式为不分流进样,色谱柱采用DB-FFAP(60 m×0.32 mm×0.25 μm)。升温程序：起始温度40 ℃,保持2 min后,以4 ℃/min的速度升温至150 ℃,保持2 min,再以6 ℃/min的速度升温至230 ℃,保持5 min。

MS条件：以EI电离源为离子源,电离能量70 eV,离子源温度230 ℃,扫描范围35.00～350.00 amu。

定性分析：通过将质谱、保留指数(retention index,RI)和纯标准品进行比较,从而鉴定出挥发性化合物的结构式。RI是根据在相同色谱条件下正构烷烃(C6～C30)的线性保留时间计算的。

1.2.3 小曲清香型原酒挥发性组分定量解析

HS-SPME-Arrow-GC-MS定量挥发性组分：采用内标标准曲线法对小曲清香型原酒中的挥发性组分进行全定量解析。构建标曲过程如下所示：吸取一定量的各组分标准品,加入到10%(体积分数)的白酒模拟基质中制成混合标准母液(乙醇+乳酸,pH 4.0),并进行梯度稀释(以2为梯度稀释倍数),一共10个点,且各类标准品分开配制。在20 mL顶空瓶中加入5 mL标准品混合溶液或经稀释的酒样,加入1.5 g NaCl,在每个梯度的标准样品和酒样瓶中分别加入40 μL 1 197.10 μg/L的叔戊酸内标和其他混合内标[2-辛醇(294.08 μg/L)、乙酸-2-苯乙酯-D3(146.34 μg/L)、正己醇-D13(322.66 μg/L)、2-甲氧基苯酚-D3(307.37 μg/L)]。在与1.2.2的相同的条件下进行HS-SPME-Arrow-GC-MS解析,利用Agilent 数据分析工作站,通过计算各组分与内标峰面积和浓度的比值构建各挥发性组分的定量标准曲线,从而计算酒样中各物质的含量。

1.3 数据分析

数据采用 SIMCA 14.0 进行偏最小二乘判别分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA),利用SPSS 20.0进行单因素方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA)。

2 结果与讨论

2.1 小曲清香型原酒等级评定

综合7位专业评酒员的等级评价结果,如表1所示,68个样品中共有优级酒20个,记为Y-1～Y-20；一级酒28个,记为I-1～I-28；二级酒20个,记为II-1～II-20。

2.2 不同等级小曲清香型原酒挥发性组分含量差异

小曲清香型原酒HS-SPME-Arrow-GC-MS分析的总离子流图如图1所示,共鉴定出66种挥发性组分(表2)。

图1 小曲清香型原酒HS-SPME-Arrow-GC-MS分析总离子流图

表2 不同等级小曲清香型原酒样品挥发性成分含量范围

包括酯类23种,醇类12种,醛酮类9种,酸类10种,酚类6种,含硫化合物3种,萜烯类化合物3种。其中大部分化合物是白酒中常见的化合物[19-21],在小曲清香型白酒中新发现了13种化合物,分别为己酸丙酯、1-庚醇、4-甲基戊酸、4-甲基苯酚、4-乙基苯酚、愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚、甲硫醇、二甲基二硫、二甲基三硫、β-大马酮、土味素和β-紫罗酮。这是首次从小曲清香型白酒中鉴定出含硫化合物和萜烯类这种白酒中较为关注的“量微香大”化合物[22]。

酯类物质是白酒中的主要呈香物质,也是白酒质量鉴定的重要指标,通过醇和酸的酯化反应形成[23],且优级酒中的酯类物质含量稍高于一二级酒。醇类化合物为酿酒酵母通过分解代谢途径和合成代谢途径产生[24],高级醇的含量对白酒品质有很大的影响,醇类物质含量随着等级的降低而升高,适宜质量浓度的高级醇可以赋予酒特殊的香气,但含量过高,易产生异杂味。以乙醛和乙缩醛为代表的醛酮类化合物也大量存在于样品中,但不同等级小曲清香型白酒中的醛酮类物质在含量上相差不大。酸类化合物主要由细菌产生,含量度较低时呈现一定的奶酪香气,具有助香作用,而含量较高具有明显的酸臭味,从表2可知,二级酒中的酸类物质稍高于优级酒和一级酒。酚类物质是白酒芳香族物质中的主要成分,多在制曲过程中由微生物产生,也可由氨基酸或单宁等物质反应生成[25],不同等级小曲清香型原酒中的酚类物质在含量上相差不大。

从定量结果统计来看单一或者多种挥发性组分的含量差异无法直观的实现对原酒等级的区分和鉴别,因此,需要借助化学计量学数据分析手段对定量结果进行挖掘以获得更多的可用信息来得到更好的区分效果。

2.3 不同等级小曲清香型原酒判别模型构建

对目前企业原酒分级所依据的理化指标进行收集,包括乙醛、甲醇、正丙醇、乙酸乙酯、杂醇油,对数据进行有监督的PLS-DA分析,发现仅依赖少数理化指标数据无法实现3种不同等级的酒样的有效区分。

为了进一步提取对不同等级原酒区分有重大贡献的挥发性组分,进行了PLS-DA的研究,如图2-a所示,通过可靠的PLS-DA模型可以很好地区分3个等级样品。该模型提取的3个主成分解释了74.4%,说明这3个成分可反映样品的总体情况。此外进行了200次的置换检验,通过检验图(图2-b)可以看出所有位于左边的R2和Q2值均低于右边R2和Q2值,且Q2回归线的截距为负值,表明该模型未过拟合[26]。

Y-优级；I-一级；II-二级

变量投影重要度(variable importance for the projection,VIP)表征了分类过程中各个变量的重要性,通常VIP值大于1的变量在不同样本组之间的区分中起着重要作用。通过VIP值筛选出25个差异标记物,ANOVA分析进一步验证了这些物质含量在不同等级之间具有显著差异(P<0.05)(表3)。

表3 基于PLS-DA筛选不同等级小曲清香型原酒品质差异标记物

这些物质中除3-甲基丁醇、己酸、丁酸、戊酸、乳酸乙酯、乙酸异戊酯平均含量高于5 mg/L以外,其余物质均低于2 mg/L,说明微量化合物对于白酒品质区分具有重要意义。其中β-大马酮、二甲基三硫、甲硫醇及土味素在白酒中的的阈值[22]分别为0.12、0.36、2.20和0.11 μg/L,在不同等级小曲清香型白酒中的OAV值分别高达57～138、83～213、20～49及19～122,对小曲清香型白酒风味特征具有重要贡献。β-大马酮呈现令人愉悦的蜂蜜,玫瑰香气,其含量随着等级的降低而降低,对于白酒品质鉴别具有关键作用。

二甲基三硫和甲硫醇在低质量浓度时为白酒中的重要香气成分,其含量随等级降低而降低。土味素是白酒中泥土气味的主要来源,是重要的异嗅味物质,其含量随等级降低而增加。

PLS-DA除了对样本主要矩阵特征进行更深入分析外,在降维的同时结合了回归模型,并利用一定的判别阈值对回归结果进行判别分析[27]。为了建立一个快速准确的等级判别模型,以55个样本为训练集,以各个样本的25个差异标记物的含量为变量,提供各个样本的等级信息,使用SIMCA 14.0软件自动拟合PLS-DA判别模型,该模型基于4个主成分的R2Y(cum)= 0.995、Q2Y(cum)= 0.924,模型的解释变异度(R2Y)和预测能力(Q2Y)接近于1,表明该模型的适用性和可预测性较好[26]。模型构建好后,以13个样本为测试集对模型进行验证,图3为模型对不同等级13个样本进行判别分析的结果,从图3-a中可以看出,验证集中4个优级酒的分类变量的预测值都接近于1,在0.5～1.5之内,而其他2个等级的分类变量的预测值基本为0,在-0.5～0.5之内,从图3-b、图3-c可以看出一级酒和二级酒的预测值亦是如此。根据PLS-DA法的判别准则可知,验证集中的所有酒样都被正确的识别,即识别率为100%。

a-优级酒；b-一级酒；c-二级酒

3 结论

本研究采用HS-SPME-Arrow-GC-MS方法对68个原酒样品的挥发性组分进行了全面解析,分析了不同等级小曲清香型原酒中66种挥发性组分的精确含量。利用66种挥发性组分在所有样品中的含量对不同等级原酒进行了PLS-DA 分析,可以将68个不同等级的酒样进行有效分离,并且通过VIP值筛选出25个等级差异标记物,其中大部分物质属于白酒中“量微香大”类香气化合物,对原酒品质具有重要影响。以这25个物质在55个校正集样品中的含量构建了PLS-DA原酒等级判别模型,并选择13个样品为测试集进行验证,在判定结果中测试样本与训练样本的正确率均为100%。本研究建立的不同等级的小曲清香型原酒质量等级判别模型将进一步在企业进行推广验证,预期将为白酒原酒品质等级评价标准化提供一定的支撑。