MiR-1275促进宫颈癌Hela细胞恶性进展的机制研究

范晓丽 王义娜 张青青

宫颈癌是1种与高危型人乳头瘤病毒感染密切相关的妇科肿瘤[1]。微小RNAs(miRNAs)是1类内源性非编码RNA，其通过调控下游肿瘤相关mRNA影响肿瘤细胞增殖、转移和凋亡等生物学过程，与宫颈癌的恶性演变关系密切[2]。已有研究[3]发现miR-1275在宫颈癌组织和血清中异常高表达，但其在宫颈癌发生发展中的作用并不清楚。因此，本研究以宫颈癌Hela细胞为研究对象，探讨上调或下调miR-1275表达对Hela细胞恶性生物学行为的影响，分析其潜在靶基因，进而揭示其在宫颈癌发生、进展中的作用，以期为宫颈癌靶基因治疗提供新线索。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人宫颈癌细胞株Hela购于美国ATCC。RPMI1640培养基购于美国Sigma-Aldrich公司，胎牛血清和胰蛋白酶购于美国Gibco公司，miR-1275mimics、miR-1275 inhibitor及其相应的阴性对照miR-NC、anti-miR-NC购于美国Sigma公司，Matrigel基质胶和Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购于美国BD公司，辣根过氧化酶标记的二抗购于中杉金桥公司，逆转录试剂盒、FHIT抗体、GAPDH抗体和购于美国Abcam公司。CCK-8试剂盒购于杭州联科生物公司，SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒购于北京雷根生物公司，BCA 蛋白定量试剂盒购于北京博奥森生物公司，双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于碧云天生物技术研究所，ECL发光液和Transwell小室购于美国Millipore公司。

1.2 细胞培养、分组与转染

Hela细胞接种至含10%胎牛血清RPMI1640培养基的培养瓶，在湿度饱和、5%CO2、温度37 ℃细胞培养箱中常规培养。每2 d换液1次，胰蛋白酶消化85%融合细胞，按照1∶3比例传代。选择第5代对数期细胞进行后续实验。实验分为4组，分别为miR-NC组(转染mimics阴性对照miR-NC)、miR-1275组(转染miR-1275 mimics)、anti-miR-NC组(转染inhibitor阴性对照anti-miR-NC)和anti-miR-1275组(转染miR-1275 inhibitor)。将对数期Hela细胞以适当密度接种至6孔板上，参照脂质体2000说明书步骤将miR-1275 mimics、miR-1275 inhibitor及其相应阴性对照根据实验分组转染至75%融合的Hela细胞中。转染6 h后，换液继续培养48 h，收集各组细胞，进行后续实验。

1.3 RT-PCR检测miR-1275的表达

采用Trizol法提转染Hela细胞的RNA，紫外分光光度计法评估各组细胞总RNA的浓度。根据逆转录试剂盒说明书步骤将RNA逆转录合成单链cDNA，取1 μl cDNA作为模板，另加入10 μl qPCR masterMix、各0.5 μl浓度为10 μM上下引物和8 μlddH2O制成体积为20 μll PCR反应体系，上PCR仪进行扩增。采用2-ΔΔCt法检测miR-1275表达水平以评估转染效果。实验重复3次。其中，PCR引物由上海生工生物合成(miR-1275 F:5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’，R:5’-GCCGCTAGCTTATCGACTACG-3’,内参U6 F:5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，R:5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’)。

1.4 细胞增殖实验

在96孔细胞板上接种转染48 h后各组Hela细胞。在培养箱培养24、48和72 h后，弃培养液，加入10 μl CCK-8溶液。孵育4 h后，使用酶标仪在450 nm处检测各组细胞的光密度(OD)值。实验重复3次。

1.5 细胞侵袭与迁移实验

侵袭实验：使用50 μl 浓度为10 mg/ml的Matrigel基质胶包被24孔板内的Transwell小室的上层，置于室温条件下充分融合凝固。用无血清培养基重悬各组Hela细胞制成2×105个/ml悬液。取100 μl细胞悬液加入到Transwell小室上层，并在小室下层中加入500 μl含10%胎牛血清的培养液。培养24 h后，取出小室，以棉签擦去上层中的细胞，用甲醇固定底部细胞15 min，用0.1%结晶紫染液染色20 min。洗去染色液，室温晾干。在倒置显微镜下各组随机选取3个视野，统计穿膜细胞数。迁移实验：迁移实验步骤与侵袭实验基本一致，不同之处在于无需使用Matrigel基质胶包被的Transwell小室。实验重复3次。

1.6 细胞凋亡实验

磷酸缓冲液冲洗胰酶消化收集的各组Hela细胞，用500 μl的结合缓冲液重悬上述细胞。加入5 μl的Annexin V-FITC、5 μl的PI混匀，室温下避光反应15 min。在1 h内使用流式细胞仪分析各组细胞凋亡率。实验重复3次。

1.7 miR-1275与FHIT的靶向关系的验证实验

由百奥迈科生物公司构建含野生FHIT 3’ UTR(FHIT-WT)和突变FHIT 3’ UTR结构(FHIT-MUT)的荧光数酶报告载体。待Hela细胞达70%融合度时，参照脂质体2000说明书步骤将miR-NC、miR-1275、anti-miR-NC和miR-1275 inhibitor分别与FHIT-WT、FHIT-MUT共转染至Hela细胞，利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒评估转染48 h后各组细胞荧光素酶活性。实验重复3次。

1.8 FHIT蛋白表达的检测

用RIPA细胞裂解液提取各组Hela细胞的总蛋白。取适量2×上样缓冲液与等体积蛋白样品混匀，在95 ℃的水浴锅中变性5 min。每孔60 μg蛋白样品上样至12% SDS-PAGE凝胶以80 V恒压电泳，当溴酚蓝进入分离胶后改用120 V电压电泳至溴酚蓝跑出胶外。以200 mA恒流将蛋白样品转至PVDF膜上。采用含5%脱脂奶粉的封闭液室温封膜1.5 h后，以1∶1000倍稀释的FHIT和GAPDH一抗工作液4 ℃下孵育24 h。按照1∶2000比例稀释二抗，孵育膜1 h。滴加ECL发光液显影后，采用凝胶成像系统扫描分析目的条带灰度值(GAPDH为内参)。实验重复3次。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 miR-1275在各组Hela细胞中表达情况

RT-PCR检测结果显示，miR-1275组细胞中miR-1275表达较miR-NC组明显升高(P<0.05)；anti-miR-1275组中miR-1275表达较anti-miR-NC组明显降低(P<0.05)，见表1。

表1 各组Hela细胞中miR-1275表达水平

2.2 miR-1275对宫颈癌Hela细胞增殖的影响

CCK-8检测结果显示， 在48 h和72 h作用时间下，miR-1275组细胞的增殖活力较miR-NC组显著升高(P<0.05)；而anti-miR-1275组细胞的增殖活性与anti-miR-NC组比较明显降低(P<0.05)，见表2。

表2 各组细胞OD450 nm值的比较

2.3 miR-1275对宫颈癌Hela细胞侵袭和迁移的影响

Transwell实验检测结果显示，miR-1275组细胞侵袭、迁移数量与miR-NC组相比明显增多(P<0.05)；而anti-miR-1275组细胞侵袭、迁移数量与anti-miR-NC组比较明显减少(P<0.05)，见表3。

表3 各组中侵袭细胞数和迁移细胞数的比较

2.4 miR-1275对宫颈癌Hela细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测结果显示，miR-1275组细胞凋亡率较miR-NC组明显降低(P<0.05)；anti-miR-1275组细胞的凋亡率较anti-miR-NC组明显升高(P<0.05)，见表4。

表4 各组细胞凋亡率比较

2.5 miR-1275靶基因的预测及验证

TargetScan、miRanda及miRBase数据库软件预测显示，FHIT 3' UTR与miR-1275存在特异结合位点。荧光素酶活性检测显示，与转染miR-NC相比，转染miR-1275 mimics可明显降低Hela细胞FHIT-WT的荧光素酶活性；与转染anti-miR-NC相比，转染anit-miR-1275可明显升高其荧光素酶活性(P<0.05)；但miR-1275和anit-miR-1275对Hela细胞FHIT-MUT的荧光素酶活性影响无统计学意义(P>0.05)。Western blot检测FHIT蛋白表达(图1和表5)显示，与miR-NC组相比，miR-1275明显抑制Hela细胞中FHIT蛋白的表达；而anit-miR-1275则明显促进FHIT蛋白的表达(P<0.05)。

图1 Western blot检测FHIT蛋白的表达

表5 各组细胞的荧光素酶活性

3 讨论

miR-1275是1种与肿瘤发生和进展关系密切的miRNA。Fawzy 等[4]在肝癌中发现miR-1275异常低表达，而异位表达miR-1275可抑制肿瘤细胞的恶性生物行为。然而，miR-1275在不同肿瘤组织或细胞中的表达及其作用存在着差异。He等[5]发现，在非小细胞肺癌组织和细胞中miR-1275表达上调，而抑制miR-1275表达可抑制癌细胞的增殖、侵袭和转移。Yang等[6]发现，miR-1275在慢性粒细胞白血病中表达升高，抑制其表达抑制细胞增殖，下调凋亡抑制蛋白Bcl-2和转移相关蛋白MMP-2/9的表达，并上调促凋亡相关蛋白Caspase-3表达。Xie等[7]在膀胱癌中发现，上调miR-1275表达可通过靶向调控AXIN2恢复lncRNA miR143HG对BCa细胞的增殖，迁移和侵袭能力的抑制作用。为了探讨miR-1275在宫颈癌发生发展中的作用，本研究通过转染miR-1275 mimics和miR-1275 inhibitor 分别成功上调和下调miR-1275表达后，检测发现上调miR-1275表达可显著增加宫颈癌Hela细胞的增殖、侵袭和迁移能力，降低细胞凋亡能力；而下调miR-1275表达则得到相反的结果。这提示miR-1275通过抑制宫颈癌细胞凋亡，促进细胞增殖、侵袭和迁移在宫颈癌的恶性进展中发挥着重要的致癌作用。

FHIT是1种重要的抑癌基因，可通过调控细胞增殖、侵袭、凋亡和自噬等过程与骨肉瘤、非小细胞肺癌等多种肿瘤的发生发展密切相关[8-9]。Roz等[10]研究指出，恢复FHIT表达可诱导宫颈癌细胞凋亡并抑制肿瘤的生长。林翠波等[11]证实，FHIT在宫颈癌组织中低表达，且其表达水平与淋巴结转移有关。闫艳荣等[12]研究发现，在宫颈癌演变过程中FHIT的表达与转移相关的MMP-9表达呈现负相关。本研究通过软件预测发现，FHIT 3’UTR存在能够与miR-1275互补的结合位点。采用双荧光素酶报告基因实验证实，miR-1275可与FHIT 3’UTR靶向结合。另外，Western blot检测发现，上调miR-1275表达可抑制FHIT蛋白表达；反之，下调miR-1275表达则可促进FHIT蛋白表达。结果提示，FHIT是miR-1275的靶基因，miR-1275可通过靶向调控其表达参与宫颈癌的发生发展。

综上所述，miR-1275可促进宫颈癌细胞增殖、侵袭、迁移，抑制凋亡，进而在宫颈癌的进展中发挥致癌作用，其机制可能与靶向调控FHIT有关，这为miR-1275作为宫颈癌基因治疗的潜在靶点提供了理论依据。