TAB3、CEBPD在卵巢癌组织和卵巢癌细胞中的表达及其相关性

吴淑芳 曾克非 芦 珊

TAB3(TAK1-binding protein 3)是的 TGF-β 激活激酶 1(TAK1)的1个新的结合蛋白，参与了多个生理过程，Jin 等发现 TAB3 在结肠癌、肺癌中的表达明显高于其对应的癌旁组织[1-3]。

CCAAT增强结合子蛋白δ (CCAAT enhancer binding protein C/EBPδ，CEBPD) 属于CCAAT增强结合子蛋白家族的一员。最近研究报道CEBPD是1个抑癌基因，在乳腺癌中，Src激酶下调CEBPD表达可促进细胞增殖[4-6]，但是CEBPD在卵巢癌中的表达及其与TAB3表达的关联还不清楚。为此，我们收集51例原发性卵巢癌组织和对应的癌旁组织，通过实时荧光定量PCR、Western blot检测卵巢癌组织和对应的癌旁组织中TAB3和CEBPD的表达情况，并分析两者表达是否存在相关性。此外，通过实时荧光定量PCR、Western blot检测正常卵巢细胞和卵巢癌细胞系中TAB3和CEBPD的表达情况。

1 材料与方法

1.1 材料

经江西省肿瘤医院医学伦理委员会审批及患者知情同意后，收集51例江西省肿瘤医院妇瘤科手术切取的卵巢癌组织及癌旁组织标本，所有标本均由病理确诊，术前均未接受化疗及放疗。所有标本均由资深病理专家确诊。正常卵巢细胞株2IOSE80和卵巢癌细胞株HO-8910、SK-OV-3、OVCAR-3、COC1、Caov-4、ES-2购自中科院上海生命科学研究院细胞库。

1.2 主要试剂

兔抗人TAB3蛋白多克隆抗体(proteintech公司)，使用浓度1∶100，兔抗人CEBPD蛋白多克隆抗体(Abcam公司)，使用浓度1∶1000；带辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗体，使用浓度1∶10000(中杉金桥)；蛋白Marker 26616、天根超敏发光试剂盒、5×SDS上样缓冲液、BCA蛋白定量试剂盒(江苏碧云天公司)、蛋白抽提试剂盒(北京普利来公司)、蛋白印迹膜再生液(北京普利来公司)、细胞蛋白裂解液(北京普利来公司)；甘氨酸(Glycine)，SDS、氯化钠(NaCl)，溴化乙锭(EB)，琼脂糖(北京索莱宝科技有限公司)；氯仿，甲醇，乙醇，异丙醇、硼酸(上海化工有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 Western blot 首先总蛋白提取，然后BCA法蛋白浓度测定，接下来进行SDS-PAGE电泳，接着转膜和进行免疫反应，最后凝胶图像分析和PVDF膜再生。

1.3.2 qRT-PCR 首先RNA提取，接下来逆转录合成cDNA,最后采用SYBR Green法，在ABI PRISM 7500自动荧光PCR仪上进行，将cDNA稀释品分别梯度稀释,建立标准曲线。

反应条件：95 ℃ 15 min；95 ℃ 30 s 58 ℃ 30 s 72 ℃ 30 s共45个循环，最后72 ℃延伸7 min。

增加溶解曲线。阈值定义为循环数为Ct，依据标准曲线计算目的基因TAB3、CEBPD和GAPDH的mRNA量，每个样品TAB3、CEBPD与GAPDH基因浓度比值，即为校正后的相对含量。实验重复3次。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 检测卵巢组织中TAB3与CEBPD的表达情况

通过qQRT-PCR及western blot方法检测卵巢癌组织及对应的癌旁组织中TAB3和CEBPD的表达情况。荧光定量PCR结果发现，卵巢癌组织中TAB3 mRNA的表达明显高于癌旁组织(P<0.001)，而卵巢癌组织中CEBPD mRNA的表达明显低于癌旁组织(P<0.05)，见图1A；同样，Western blot结果发现TAB3蛋白在 62.74%(32/51)的卵巢癌组织中呈过表达，CEBPD蛋白在60.78%(31/51) 的卵巢癌组织中呈低表达(P<0.05),见图1B、C。上述结果说明在卵巢癌组织中TAB3基因的表达明显升高，而CEBPD基因的表达明显下降。

A：qRT-PCR检测51例卵巢癌患者的癌组织和对应癌旁组织中TAB3 及CEBPD mRNA的表达情况；B-C：Western blot 分析在卵巢癌组织和对应癌旁组织中TAB3和CEBPD蛋白的表达(部分典型病例)，其中T代表癌组织，N代表癌旁组织。

2.2 TAB3和CEBPD基因在卵巢癌组织中表达的关联性

我们进一步分析TAB3和CEBPD基因在卵巢癌组织中表达的相关性，散点图结果发现卵巢癌组织中TAB3和CEBPD的mRNA表达呈负相关性(γ=-0.2853，P<0.05)，见图2A。此外，在卵巢癌组织中TAB3和CEBPD蛋白表达也同样呈现负相关性(γ=-0.3091，P<0.05)，见图2B。

图2 TAB3与CEBPD mRNA和蛋白的相关性

2.3 卵巢细胞IOSE80和卵巢癌细胞株中TAB3和CEBPD的表达情况

通过qRT-PCR检测正常卵巢细胞株IOSE80和卵巢癌细胞株 HO-8910、SK-OV-3、OVCAR-3、COC1、Caov-4、ES-2中TAB3和CEBPD mRNA的表达情况，结果发现卵巢癌细胞株中的TAB3 mRNA表达明显高于正常卵巢细胞株IOSE80，CEBPD mRNA表达明显低于正常卵巢细胞株，见图3A。同时，我们利用Western blot检查正常卵巢细胞株IOSE80和卵巢癌细胞株HO-8910、SK-OV-3、OVCAR-3、COC1、Caov-4、ES-2中TAB3和CEBPD蛋白的表达情况，结果也发现在卵巢癌细胞中TAB3蛋白的表达比正常卵巢细胞株IOSE80高， 而CEBPD蛋白表达比正常卵巢细胞株IOSE80低，见图3B。

图3 正常卵巢细胞IOSE80和卵巢癌细胞株中TAB3及CEBPD基因和蛋白的表达情况

3 讨论

研究报道TAB3在许多恶性肿瘤，如肺癌、乳腺癌及食管癌中发现过高表达，而且TAB3途径被认为可以作为癌症的靶向治疗[2-3,5]。研究已经证实TAB3的表达与卵巢癌的卫星灶形成密切相关，同时发现降低卵巢癌细胞中TAB3的表达，可以明显抑制细胞的侵袭和迁移。我们研究也发现TAB3在卵巢癌组织中过表达，过表达TAB3可导致卵巢癌细胞的增殖、侵袭和转移能力明显增加。综上，TAB3在卵巢癌的发生和发展中起着重要作用。

CCAAT增强结合子蛋白δ (CCAAT enhancer binding protein C/EBPδ，CEBPD) 属于CCAAT增强结合子蛋白家族的一员，它可以调节细胞多种生物学活性，其中包括细胞分化、生长、增殖和细胞凋亡[4]。最近研究报道CEBPD是1个抑癌基因，其在肿瘤的增殖过程中起重要作用。研究发现CEBPD在乳腺癌、神母细胞瘤等多种肿瘤中呈低表达，并且与肿瘤细胞的增殖、凋亡密切相关。在慢性粒细胞白血病细胞中过表达CEBPD可以促进P28的蛋白表达，从而抑制白血病细胞增殖[6-7]。

本实验通过实时荧光定量和Western blot 检查卵巢癌组织中的TAB3和CEBPD的表达情况，结果显示在卵巢癌组织中TAB3呈现高表达，同时，我们的实验也发现CEBPD在卵巢癌组织中低表达，我们进一步通过散点图分析发现TAB3和CEBPD在卵巢癌组织中表达存在负相关性。另外，我们通过荧光定量PCR及Western blot检测了一株正常卵巢细胞株IOSE80和卵巢癌细胞 HO-8910、SK-OV-3、OVCAR-3、COC1、Caov-4、ES-2中TAB3和CEBPD的mRNA和蛋白表达情况，结果发现在卵巢癌细胞株中TAB3表达情况明显高于正常细胞株IOSE80，而CEBPD表达情况明显低于正常细胞株IOSE80，且两者表达趋势呈负相关。综上所述，在卵巢癌组织及细胞中TAB3与CEBPD的表达呈负相关，且TAB3和CEBPD均与卵巢癌细胞的增殖密切相关。因此我们推测在卵巢癌中TAB3可能通过调控CEBPD的表达而影响细胞的增殖，然而其具体调控机制有待我们进一步去探讨。