核桃青皮主要功能成分变化规律

左力翔，牛 艳，安晓宁，高 磊，秦国杰

（山西农业大学园艺学院，山西太原030031）

核桃青皮占果实质量的1/2 以上，含有大量生物活性物质。近年来，越来越多的研究集中于开发这些活性物质的生物化学功能，为提升核桃青皮资源价值提供更多潜能。有研究指出，核桃青皮提取物对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭具有明显抑制作用[1]；NH2SO3H 溶液中加入核桃青皮提取物对冷轧钢具有缓蚀作用[2]；产蛋后期添加核桃青皮提取物可维持蛋鸡的产蛋性能[3]；5%的核桃青皮乙醇提取物不仅对无花果果实具有保鲜效果，且无花果果实的品质和风味均能得到较好的保持[4]。除此之外，核桃青皮还应用于生物有机肥、杀虫灭菌剂、染色剂及天然食用色素等很多方面[5-9]。这些研究结果为核桃青皮高值利用提供了大量实践经验和理论依据。

新形势下，核桃产业已发展成为宜栽区农民脱贫增收的主要致富产业[10-11]。发展核桃青皮高值利用产业对改善农业生态环境、提高核桃产业经济效益具有重要意义。核桃青皮中的醌类、酚类以及多糖是核桃青皮最主要的3 种活性成分，具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、杀虫、化感作用等[12-14]。目前对于核桃青皮主要活性物质的研究大多集中在提取、功能和应用方面[15-19]，对于何时收获可以最有效地获取此类物质的研究较少。杨漓等[20]研究了不同核桃品种核桃青皮中胡桃醌含量的变化规律，结果发现，核桃青皮中胡桃醌含量在7 月下旬到8 月初达到峰值，然后随着果实成熟逐渐下降。王红霞等[21]通过对6 种核桃青皮多糖含量变化规律的研究发现，果壳硬化期核桃青皮多糖含量最高，果实速长期次之，成熟期最低。SHI 等[22]对核桃青皮中酚类物质的季节变化规律研究发现，8 月下旬酚类物质含量开始下降。以上研究分别讨论了不同地区单种功能成分的季节变化规律。但目前依然没有同时分析核桃生育期青皮中醌类、酚类和多糖的变化规律的研究，且山西省本地核桃品种青皮中功能成分的季节变化规律尚未开展相关研究。

为提高核桃青皮功能成分的利用效率，本研究以山西省汾阳核桃主产区主栽品种晋龙1 号为材料，研究了不同生长时期核桃青皮中的醌类、酚类及多糖含量的变化规律，旨在为核桃青皮功能成分的高值利用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

2019 年 6 月 15 日至 9 月 15 日，每隔 15 d 分别采集山西省汾阳市威雄经济林合作社优种核桃苗木繁育基地的晋龙1 号（树龄20 a）核桃，将核桃青皮50 ℃条件下烘干，粉碎、封装后保存于冰箱（4 ℃）备用。

1.2 试剂及仪器

无水乙醇，丙酮，乙醚，福林- 酚，碳酸钠，没食子酸，苯酚，浓硫酸，葡萄糖，冰乙酸，氢氧化钠，氨水，胡桃醌标准品，所有试剂药品均为分析纯，并不做其他任何二次处理。去离子水通过电阻率为18.2 Ω/cm 的ELGA PURELAB 超纯水设备制得。

恒温水浴锅（常州国华电器有限公司），超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司，KQ5200DE），紫外可见分光光度计（安捷伦，Cary8454），超高效液相色谱仪（岛津，LC-30）。

1.3 高效液相色谱鉴定核桃青皮内物质种类

称取0.500 0 g核桃青皮样品，加入5 mL 甲醇∶水＝1∶1（体积比），浸泡 4 h，随后 40 ℃超声处理40 min；然后于 4 ℃下 12 000 r/min 离心 10 min，取5 μL 上清液进行高效液相色谱检测。

色谱条件：色谱柱为Waters HILIC BEH Column（100 mm×3 mm，1.7 μm），流速为 0.300 mL/min，柱温为35 ℃。流动相A 为乙腈（acetonitrile），流动相B 为0.1%乙酸（CH3COOH-H2O）。具体流动相比例及其时间为：流动相A 5%、流动相B 95%，0 min；流动相A 50%、流动相B 50%，10 min；流动相A 95%、流动相B 5%，13 min；流动相A 5%、流动相B 95%，14 min；流动相A 5%、流动相B 95%，16 min。

1.4 总醌含量的测定

根据报道方法并做相应调整测量总醌含量[23]。将核桃青皮样本过0.425 mm 筛之后，称取约0.025 0 g，加入6 mL 混合酸（25%盐酸∶冰乙酸＝2∶18（体积比）），沸水浴回流15 min，冷却至室温，加入8 mL 乙醚洗涤残渣，取出上清液，重复洗涤3 次，每次6 mL，将3 次得到的上清液样品合并于分液漏斗中。在分液漏斗中先加入20 mL 的混合碱（10%氢氧化钠∶4%氨水＝1∶1（体积比））进行萃取，取出下层溶液，重复萃取3 次至乙醚层无色，合并3 次萃取得到的下层溶液，放置30 min，同时以混合碱为空白于525 nm 处检测吸光度。重复3 次。

1.5 总酚含量的测定

研究采用福林- 酚法测定样品中总酚含量[24-25]。将核桃青皮样品过0.425 mm 筛之后，称取约0.025 0 g，加入1 mL 60%乙醇提取液，先在60 ℃水浴处理10 min，然后超声处理30 min，最后于12 000 r/min 离心10 min，待测。重复3 次。

1.6 多糖含量的测定

采用苯酚- 硫酸法检测多糖[26]。将样本过0.425 mm筛，称取约0.025 0 g，加入6 mL 二次水并用封口膜封盖，之后沸水浴5 min，然后离心10 min（4 000 r/min，25 ℃）。离心结束后取 200 μL 上清液加入95%乙醇，静置过夜。最后，将静置后的溶液离心10 min（12 000 r/min）并去除上清液，沉淀分别用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2 次，再加入6 mL 去离子水振荡至溶解，随后稀释10 倍，待测。重复3 次。

1.7 标准曲线的绘制

总醌标准曲线以胡桃醌为标准品，分别配制180、120、60、12、6、0 μg/mL 的标准溶液，在 525 nm处测量其吸光度值。总酚标准曲线以没食子酸为标准品，分别配制 124、62、31、15、7.5 μg/mL 的标准溶液，在760 nm 处测量其吸光度值。多糖标准曲线以葡萄糖为标准品，分别配制 100、80、60、40、20、0 μg/mL 的标准溶液，在490 nm 处测量其吸光度值。

1.8 数据分析

数据采用Excel 和Origin Pro 8.5 进行处理与分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制结果

从图1 可以看出，总醌标准曲线方程为：y＝0.007 8x－0.013 2（R2＝0.999 8）。总酚标准曲线方程为：y＝0.004 4x－0.008 3（R2＝0.999 8）。多糖标准曲线方程为：y＝0.003 2x－0.006 5（R2＝0.996 5）。结果表明，在各自相应的检测范围内各标准品浓度与吸光度值具有良好的线性关系，可用于检测核桃青皮内总醌、总酚以及多糖的含量。

2.2 核桃青皮生物活性物质种类鉴定分析

为确定核桃青皮含有的生物活性物质的种类，采用高效液相色谱对核桃青皮进行鉴定分析。从图2 可以看出，通过鉴定发现，该核桃青皮样品内共有107 种各类活性物质。其中，酚类主要包括黄岑素、儿茶素、飞燕草素、花旗松素、杨梅素、柚皮素、刺槐黄素、黄豆苷等在内的黄酮类，包括没食子酸、绿原酸、阿魏酸、丁香酸、咖啡酸、鞣花酸、斛皮素、胡桃醌等在内的单体酚酸，以及水解单宁。醌类物质主要包括胡桃醌、羟基茜草素、1，4- 萘二酮、2，5- 二甲氧基苯醌、核桃酮等。糖和糖苷包括D 苏糖、番石榴苷、葡萄糖苷、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖等。除此之外，还包括氨基酸（缬氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、蛋氨酸、胱氨酸等）、有机酸（乌头酸、尿酸、富马酸、琥珀酸、苏糖酸、龙胆酸、壬二酸、柠檬酸、酒石酸、粘酸、亚油酸、亚麻酸、反式牛磺酸等）、生物碱（葫芦巴碱、禾草碱、胆碱、D- 肉碱、磷酸胆碱、毛果芸香碱、胡椒碱等）、维生素（生物素、维生素B5等）、其他结构的生物活性物质（黄豆苷、科罗索酸、异樱草苷7-O- 新橙皮苷、苯并噻唑等）和一些盐如葡萄糖酸盐等。其中，酚类物质达19 种之多，醌类物质虽然种类比较少，但是单种成分含量较高。郑晓宁等[27]研究表明，胡桃醌在核桃青皮中的含量最高。此外，样品中的多糖含量也较为丰富，共检测到6 种主要单糖成分，与谢东雪等[19]对多糖分离纯化的研究结果类似。如此丰富的活性物质使核桃青皮具有抗菌、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗真菌、杀幼虫、防腐等一系列功能。如表1 中列举的具有抗菌、抗氧化、抗突变作用的香豆酸；具有抗肿瘤、抗真菌、杀幼虫作用的香豆素；对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、大肠杆菌及绿脓杆菌均有不同程度抑制作用的对香豆酸；具有消炎、抗渗出、增加静脉张力、改善血液循环以及纠正脑功能失常等作用的七叶皂苷；具有抗菌消炎、清除自由基的柚皮素；具有抗真菌和抗肿瘤的鹰嘴豆素A；具有抗菌、抗病毒的绿原酸；用于抗病毒、杀菌剂、抗氧化剂、杀虫增效剂的芝麻素以及可用作食品防腐剂的壬二酸等。这些功能成分表明，核桃青皮作为一种农业资源具有巨大发展潜力。因此，本研究基于此结果检测此3 类物质的总量，并研究果实发育过程中此3 类物质在核桃青皮内含量的变化规律。

表1 核桃青皮中部分生物活性物质

2.3 核桃青皮内总醌、 总酚及其多糖含量的生长期变化规律

不同产地、品种核桃所经历的果实生长发育时间不同，大体经历缓慢生长期、快速膨大期、硬核期和种仁成熟期[28]。本试验研究了从快速膨大中期（6 月15 日）到种仁成熟期（9 月15 日）核桃青皮中总醌、总酚及其多糖的变化规律。由图3 可知，6 月15 日总醌含量相对较低，约53.36 mg/100 g，且增长速率较慢，到7 月1 日仅增长至55.36 mg/100 g，进入7 月以后总醌含量不断增加并在7 月30 日达到最高，为77.36 mg/100 g，之后逐渐降低并且降低的速率逐渐增加，到9 月15 日达到最低，为36.76 mg/100 g。

由图4 可知，核桃青皮内总酚含量的变化规律同总醌类似，开始阶段均保持较低的含量和增长率，从6 月15 日到 7 月 1 日仅增加2 mg/100 g。进入7 月后含量迅速积累，并在7 月上旬增速最大，8 月15 日达到最大，为50.64 mg/100 g，比总醌稍有滞后，然后含量迅速降低，最终在种仁成熟阶段达到最低，为18.97 mg/100 g。

由图5 可知，多糖含量的变化规律也呈现先增后减的变化趋势，但是整体趋势提前，在7 月15 日达到最高，为212.23 mg/100 g，后开始逐渐降低，同样在种仁成熟期达到最低，为86.82 mg/100 g。

3 结论与讨论

对比3 种物质含量的变化趋势可以发现，从6 月15 日开始3 种物质增长速率都相对缓慢，这可能是由于核桃快速膨大期的光合同化产物及其矿质元素主要用于核桃的生长[29]，同时该阶段果实增长速率很快，抵消了部分醌类、多酚及多糖的积累速率，使其表现出来的单位质量内的增量不大[22]。当核桃生长至硬壳期，核桃个体生长缓慢，同时醌类、多酚、多糖等物质合成速度加快，因此，表现出各种成分的含量急剧上升。此外，有研究表明，该时期各种功能性成分的增多有利于核桃缓解此时高温、高辐射等不利条件带来的环境压力[30]。当核桃生长至种仁成熟期，此时的生长中心转移至核桃仁，大量的能量用于合成核桃仁内的蛋白质和脂肪，因此，核桃青皮内的各种功能成分含量开始下降。此外，当核桃成熟之后核桃青皮表面会产生裂痕，加速醌类和酚类物质的氧化，使其含量加速下降。对于多糖而言，不仅在果实膨大期需要大量的糖分，在果壳硬化期为了给果仁成熟期的发育做准备，也需要大量糖分的积累。因此，糖分等营养物质积累非常迅速，从而更早达到最高值；当核桃进入种仁成熟期，核桃青皮中包括钾在内的各种元素增多，促进糖分的加速转化，因此，多糖含量最低。

根据本研究结果，可以将快速膨大中期（6 月15 日）到种仁成熟期（9 月15 日）的核桃青皮内功能成分的积累大致分为4 个阶段。第1 个阶段为缓慢增长期，第2 个阶段为快速增长期，第3 个阶段为稳定期积累期，第4 个阶段为快速消耗期。醌类、多酚和多糖3 类物质在具体变化节点上存在差异，但都经历上述4 个阶段。如：本研究中总醌含量在7 月30 日达到最大，这与杨漓等[20]的研究结果类似，该研究认为核桃青皮中胡桃醌的含量在7 月下旬到8 月初达到峰值，然后随着果实成熟呈下降趋势。SHI 等[22]研究了不同发育阶段（4 月 25 日至 9 月19 日）核桃青皮酚类物质含量及抗氧化活性的变化规律，结果表明，总酚含量在快速膨大期出现了下降，硬壳期呈上升趋势直到8 月初达到最高，之后呈下降趋势，完全成熟后达到最低值。本研究中总酚含量在8 月15 达到最高，之后快速下降并在成熟期达到最低，与其研究结果类似。同样，本研究中多糖含量在果壳硬化期达到峰值，与王红霞等[21]的研究结果一致，其含量的变化规律和进程具有相似性。

本研究讨论了核桃青皮功能成分变化规律同核桃仁生长发育规律之间的关系。由于核桃的生长发育是以核桃仁为核心，核桃青皮中各种营养及其功能成分的变化规律应与核桃仁的发育进程具有相关性。因此，今后应进一步研究核桃青皮中功能成分的转移及转化规律，为揭示核桃青皮与核桃仁中各种营养成分在生长发育过程中的关系等方面具有重要启示。