大豆不同品种泌蜜量和花朵挥发性成分分析

雷 佳 ，马卫华 ，李 捷 ，武文卿 ，宋怀磊 ，宋卓琴 ，申晋山 ，李立新 ，王 怡

（1.山西农业大学园艺学院，山西太原 030031；2.山西农业大学棉花研究所，山西运城044000）

大豆（Glycine mas（L.）Merr）属于豆科蝶形花亚科大豆属1 年生草本植物，在我国栽培历史悠久。大豆不仅是重要的粮食作物，其种子也含有丰富的植物蛋白质，可作为含有蛋白质原料的动物饲料。大豆在自然条件下异交率较低，由于是自花授粉作物，普通的大豆品种不需要昆虫授粉就能够结实。在生产大豆杂交种时，需要通过人工授粉或昆虫传粉来进行不育系繁育和杂交种制种。有研究表明，大豆杂交种制种产量低、成本高是制约杂交大豆生产的瓶颈，开花授粉环节是关键[1-2]。因此，目前大豆杂种优势利用研究和杂交大豆生产研究的热点是利用昆虫传粉。大豆有完整的蜜腺，开花时泌蜜具有典型的虫媒花特征。花蜜是植物蜜腺分泌出来的一种甜液，是植物提供给访花者最重要的报酬之一，也是影响访花者访花行为的重要性状[2-3]。SEVERSON 等[4]对不同大豆品种花蜜特性进行了研究，结果表明，白花品种和紫花品种在花蜜性状上无明显差异；其中，时间是影响大豆花蜜性状的主要因素。日温差对花蜜性状的影响最小。在单个采样周期内进行比较的结果表明，不同品种花蜜特性存在的差异可能鼓励蜜蜂优先进行采蜜。大豆泌蜜与气候、土壤条件、地域性及品种有着密切关系。韩月鑫等[5]对油菜花蜜的单花泌蜜量、单花蜜腺面积以及其花蜜化学成分进行研究，通过选择吸引昆虫访花的品种来提高油菜产量。研究表明，植物通过分泌花蜜目的是吸引传粉者和阻挡微生物侵染，最终提高自身繁殖适应能力[2]。宋志峰等[6]研究发现，不同品种大豆花中挥发性组分含量存在一定的差异。

本研究采用顶空固相微萃取和气相色谱- 质谱联用技术[7-8]以及毛细管法[9]，对不同大豆花挥发性物质和单花泌量进行测定分析，以期为大豆花朵性状与昆虫传粉关系的深入研究以及优先考虑吸引昆虫访花授粉的品种选育提供技术基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为4 个大豆品种Z-119-99、JD-19、Z-17 和ZJ-7，种植于山西农业大学东阳试验基地，由山西农业大学农业基因资源研究中心（山西省农业科学院农作物品种资源研究所）杂交大豆育种课题组提供，其中，JD-19 为常规种，ZJ-7 为杂交种。

1.2 试验方法

1.2.1 花蜜收集 试验使用0.3 mm×100 mm 的毛细管[9]在 9：00、10：00、11：00、12：00、13：00、14：00、15：00、16：00 进行花蜜收集，每个品种分别取单朵花的花蜜，重复15 次。泌蜜量用泌蜜体积表示。

1.2.2 大豆花顶空固相微萃取和气相色谱- 质谱联用技术分析 气相色谱条件：载气为氦气99.99%，流量为1 mL/min，进样口温度恒温250 ℃，分流比50∶1。初始温度 50 ℃，恒温 25 min，以5 ℃/min 升温至 170 ℃，恒温 5 min，再以 10 ℃/min升温至230 ℃，恒温10 min。EI 源电子能量为70 eV，传输线温度为250 ℃，离子源温度为230 ℃，扫描质量范围为40～600 amu。

称取盛花期大豆花样品2.0 g（每个品种3 个重复），放到20 mL 顶空样品瓶中，70 ℃条件下恒温预热30 min，将萃取头在250 ℃条件下活化35 min后插入顶空瓶中进行萃取30 min，之后将萃取头拔出（GC-MS 进样口 250 ℃）解吸 3 min。

采用顶空固相微萃取和气相色谱- 质谱联用技术（GC-MS）测定JD-19 和ZJ-7 大豆花挥发性成分[10-12]，得到GC/MS 总离子流图，利用NIST/WIELY标准质谱数据检索大豆花各组分质谱数据进行定性分析；每个样品重复测定3 次，最后采用面积归一化法，计算不同品种大豆花挥发性组分的相对含量。

1.3 数据分析

试验数据用平均值±标准误表示，采用SPSS21.0软件Means 和ANOVA 中的Duncan 进行数据统计分析和检验大豆不同品种间差异显著性（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同大豆品种在一天中不同时间单花泌蜜量的变化分析

从图 1 可以看出，在一天中 9：00、10：00、11：00、12：00 和 14：00，大豆品种 JD-19 的单花泌蜜量均最高，其中，Z-119-99、JD-19 与 Z-17、ZJ-7 之间泌蜜量差异显著（P＜0.05）。在 15：00 和 16：00 时，大豆品种Z-119-99 显著高于其他3 个品种，其他3 个品种之间差异不显著（P＞0.05）。在9：00 时，大豆品种JD-19 单花泌蜜量为 0.313 6 μL，其次是Z-119-99，其单花泌蜜量为 0.277 9 μL，二者之间泌蜜量差异不显著（P＞0.05）；品种JD-19 泌蜜量与 Z-17、ZJ-7 之间差异显著（P＜0.05）。

品 种 Z-17 和 ZJ-7 在 9：00、10：00、11：00、12：00、13：00、14：00、15：00、16：00 这 8 个时间点之间差异均不显著（P＞0.05）；在13：00，品种Z-119-99 和 JD-19 的泌蜜量与 Z-17 和 ZJ-7，且差异显著（P＜0.05）；在 14：00，品种 JD-19 的泌蜜量显著高于 Z-17 和 ZJ-7 这 2 个品种（P＜0.05），但随着时间增加，在 15：00，JD-19、Z-17 和 ZJ-7 之间差异不显著（P＞0.05）。

2.2 不同大豆品种在不同时间单花泌蜜量的动态变化

从图 2 可以看出，在 9：00，品种 JD-19 单花泌蜜量高于其他3 个品种，随着时间的推移，4 个品种泌蜜量均呈上升趋势，JD-19 在11：00 泌蜜量达到最高值，泌蜜量为0.7 μL，之后呈逐渐下降趋势，16：00 下降到最低值，泌蜜量仅为0.13 μL。品种Z-119-99 在13：00 泌蜜量达到最高值。品种Z-17和ZJ-7 从9：00 开始随着时间推移，泌蜜量呈上升趋势，在11：00 时，品种ZJ-7 单花泌蜜量达到最高值，之后逐渐下降，在 12：00 时，品种 Z-17 泌蜜量达到最高值，之后呈缓慢下降趋势。由此可以看出，4 个大豆品种泌蜜量变化从9：00 开始逐步升高，在13：00 以后呈逐步下降趋势。15：00 时，品种 ZJ-7 和Z-119-99 又出现小高峰。

2.3 大豆花挥发性成分分析

2 个大豆品种JD-19 和ZJ-7，通过采用气相色谱- 质谱分析，测定出大豆花不同组分的质谱总离子流图（图3），并采用质谱- 计算机联用仪进行分析鉴定，结果表明，大豆品种JD-19 和ZJ-7 中分别有41、40 种挥发性成分，分别为3- 辛酮、十三烷、1- 辛烯-3- 酮、正十五烷、芳樟醇、十一醛、苯乙醛、苯乙醇、棕榈酸异丙酯、庚酸、顺茉莉酮等化合物。最后采用面积归一化法，计算得到2 个大豆品种不同成分的相对含量（表1）。

表1 2 种大豆花中挥发物成分分析

从表1、图4 可以看出，JD-19 中醇类相对含量为63.22%，其中，以1- 辛烯-3- 醇的相对含量最高，为56.20%，其次为芳樟醇和1- 辛醇，其相对含量分别为2.08%和1.82%，3- 辛醇和1- 十五醇的相对含量分别为0.79%和0.66%。可以得出，JD-19 大豆花挥发物主要为醇类，酮类和酯类种类分别为8、6 种，但是较醇类含量相对较少。

ZJ-7 中挥发性成分中，醇类以1- 辛烯-3- 醇的相对含量最高，为52.74%，其次是1- 辛醇（3.14%）和3- 辛醇（2.47%）；硬脂醇相对含量最低，为0.13%。因此，ZJ-7 大豆花挥发物主要为醇类。烷烃类中十三烷相对含量较高，为1.72%。

研究报道中把含量较高、所占百分比较大的成分定义为挥发性主要成分（相对含量在3%以上）[7]。相对含量居中（1%～3%）的化合物成分定义为次要成分，种类较少或含量较低定义为修饰成分（相对含量在1%以下）。

ZJ-7 大豆花挥发物的主要成分为：3- 辛酮、1-辛烯 -3- 酮、1- 辛烯 -3- 醇、3，5，5 三甲基 2- 己烯、1- 辛醇；次要成分为十三烷、3- 辛醇、芳樟醇、乙酸癸酯、6，10，14- 三甲基 -2- 十五烷酮、7，9- 二叔丁基 -1- 氧杂螺[4.5]癸 -6，9- 二烯 -2，8- 二酮；修饰成分含量较少而种类却较多，由29 种化合物组成。JD-19 大豆花挥发物的主要成分为：3- 辛酮、1- 辛烯 -3- 酮、1- 辛烯 -3- 醇、6，10，14- 三甲基-2- 十五烷酮；次要成分为3，5，5 三甲基2- 己烯、芳樟醇、乙酸癸酯、1- 辛醇；修饰成分含量较少而种类较多，由33 种化合物组成。

3 结论与讨论

本研究对4 个品种大豆单花泌蜜量进行测定，结果表明，在一天中不同时间不同品种间泌蜜量存在一定差异。4 个大豆品种 Z-119-99、JD-19、Z-17、ZJ-7 在一天中泌蜜量达到峰值的时间点分别为13：00、11：00、12：00、11：00。内在和外在因素相互作用共同影响蜜源植物开花泌蜜量。内在因素主要为遗传性方面，气候（温度和湿度）、降雨量、栽培土壤质地等因素是影响蜜源植物泌蜜量的外在因素[13-18]。在栽培的蜜源植物中存在品种间的差异，从而造成不同植物的泌蜜特性（泌蜜量、泌蜜时间和花蜜浓度）存在差异。SEVERSON 等[4]研究发现，一天中不同时间是影响大豆泌蜜量大小的主要因素；其花蜜中的果糖、葡萄糖、蔗糖和总碳水化合物含量均随时间的增加呈上升趋势，而花蜜体积则随时间的增加而逐渐降低。本研究发现，一天中4 个大豆品种单花泌蜜量之间的差异可能是由于供试品种、栽培环境等原因造成的，掌握不同品种间单花泌蜜量变化趋势，可为今后进一步研究大豆泌蜜量和传粉昆虫之间的关系奠定基础，优先考虑吸引昆虫访花授粉的品种，为今后大豆新品种选育和提质增产提供新的评价指标[19]。

在自然界中，昆虫觅食信号是植物花朵释放的不同的挥发性物质。植物通过发出觅食信号来吸引传粉昆虫，达到为花朵授粉的目的，从而保证了植物界不同植物的繁衍进化。这些花朵挥发性物质在植物与动物之间发挥着极其重要的作用。在自然界，植物种类不同，释放的花朵挥发性物质会存在一定差异。刘健等[20]对健康大豆、大豆蚜及蚜害大豆植株复合物、机械损伤大豆挥发物成分进行了提取和组分分析，一共检测出31 种挥发性化学物质。本研究采用顶空固相微萃取和气相色谱- 质谱联用技术，测定2 个品种JD-19 和ZJ-7 大豆花散粉后的挥发性物质成分，结果表明，JD-19 和ZJ-7 测得的挥发性物质种类分别为41、40 种，其中，1- 辛烯-3- 醇在2 个大豆品种中含量最多，具有强烈的清香味（米糠油和药草样味）。在自然界中，薄荷类、水果类（香蕉和浆果）、猪肉、大豆、鲜蘑菇中含有1- 辛烯-3- 醇，类似于香料物质[21-28]。由此可见，1-辛烯-3- 醇为大豆花气味的主要贡献化合物。JD-19中酮类化合物检出8 种，其相对含量为16.66%，其中，1- 辛烯-3- 酮和3- 辛酮相对含量分别为5.1%和3.5%。ZJ-7 中1- 辛烯-3- 酮和3- 辛酮相对含量分别为10.96%和4.06%。在牡蛎和鱼肉挥发成分测定中都有检测出3- 辛酮，由此可知，3- 辛酮有可能会使大豆花朵气味具有豆腥味[6-7，29]。JD-19 中烃类化合物检出8 种，其中，烷烃类7 种，烯烃类1 种，其相对含量分别为3.91%和2.92%。ZJ-7 中烃类化合物检出7 种，烷烃类6 种、烯烃类1 种，相对含量分别为3.13%和3.15%。研究表明，嗅觉阈值较高的烷烃类化合物，可能对气味贡献作用不明显，同时酯类和烯烃类化合物可能对气味特征贡献也很小[6-7]。醛类化合物在JD-19 中检出4 种，ZJ-7 中检出3 种，油脂特征气味的主要成分是醛类化合物。本研究检测到的大豆鲜花挥发物成分种类和含量与文献[6]会有一些出入，可能与试验方法、大豆品种和地域环境等多方面因素有关。本研究通过对大豆挥发性成分进行分析，获得了2 个品种间大豆植株挥发物成分种类和含量，结果对于传粉昆虫相关领域研究工作的开展具有一定的参考价值[30]。试验中，尚需对大豆的全生育期挥发物释放情况进行细致分析，可为进一步开展大豆挥发物对传粉昆虫吸引的研究奠定基础。

志谢：特别感谢山西农业大学基因资源研究中心（山西省农业科学院农作物品种资源研究所）杂交大豆育种课题组在田间试验方面给予的大力帮助。