小麦TraesCS7A02G543300 基因的克隆及生物信息学分析

杨 茜，黄文芳，王雪琳，任豫超，史敏莉，贺立恒

（山西农业大学农学院，山西太谷030801）

小麦（Triticum aestivumL.）是世界三大粮食作物之一，其种植面积在谷物类作物中位居首位，是全球2.5 亿余人的主粮[1]。小麦还为人类提供了约21%的膳食热量和20%的蛋白营养，在保障粮食安全方面发挥着突出作用[1-3]。

气孔作为植物水分排出和二氧化碳进入的主要通道，其状态强烈影响着蒸腾作用和光合作用的生理过程[4]。在拟南芥中，表皮成熟的气孔是由表皮原细胞（Protodermal cell，PC）经一系列的分裂和分化活动发育而来的，3 种紧密相关的basic helixloop-helix（bHLH）家族蛋白 SPCH、MUTE 和 FAMA介导了这一过程[5]。其中，SPCH 是气孔发育起始的关键因子，控制着PC 向拟分生组织母细胞（Meristemoid mother cell，MMC）的分化和 MMC 向拟分生细胞（Meristemoid cell，MC）的分裂[6]；MUTE 控制着 MC向保卫母细胞（Guard mother cells，GMCs）的分裂[7]；FAMA 控制着 GMC 向成熟保卫细胞（GC）的转变[8]。研究发现，ICE1/SCREAM（SCRM）和 SCRM2 直接与SPCH、FAMA 和MUTE 相互结合形成二聚体，并影响其功能发挥[5]。此外，为了协调发育中的气孔和表皮细胞之间的信号，防止气孔彼此相邻形成，许多胞外质膜结合蛋白也是必不可少的[9]，包括表皮模式因子EPF 以及EPF-like 信号肽、Leu-rich repeat ERECTA 家族受体激酶以及TOO MANY MOUTHS（TMM）[10-11]。

单子叶植物和双子叶植物的气孔形态有着较大的差异，其中，单子叶植物的气孔成排排列，呈哑铃型；双子叶植物的气孔在叶片上不规则排列，呈肾型[12]，尽管二者在气孔形态上存在较大的差异，但陆生植物气孔形成的基本机制是相对保守的[13]。在水稻中，OsSPCH、OsMUTE、OsFAMA和OsICE1是成熟气孔形成所必需的，其基本功能与拟南芥同源基因类似[14-15]。在现存最古老的气孔谱系植物苔藓中，成熟气孔的形成同样需要拟南芥中SPCH、MUTE、FAMA和ICE/SCRM的同源基因PpSMF1和PpSCRM1的介导[16-17]。在小麦近缘种二穗短柄草（Brachypodium distachyon）中，气孔发育的起始同样是由BdISCRM、BdSPCH1和BdSPCH2组成的气孔发育模块调控的[18]。

ICE1/SCRM 与 SPCH、MUTE 和 FAMA 的伙伴关系对于单子叶植物气孔的启动和成熟是必不可少的，但它们在单子叶植物中的蛋白功能可能与拟南芥中略有不同[14，19]。例如，在禾本科植物二穗短柄草中，存在着ICE1 和SCRM2 功能的特异化，而在拟南芥中这些蛋白似乎是冗余的[12，14]。类似地，在二穗短柄草中也发生了新的SPCH 重复和新功能化[20]，MUTE 对于二穗短柄草气孔的副卫细胞的形成具有决定性作用[18]。

中国农业科学院小麦基因资源课题组利用基因定位获得了1 个与小麦气孔密度相关的候选基因TraesCS7A02G543300。本研究利用生物信息学软件对小麦TraesCS7A02G543300基因的基本理化性质、蛋白质结构等进行分析，同时利用RT-qPCR分析小麦根、叶、茎在3 个时期的基因表达模式，旨在为进一步研究小麦TraesCS7A02G543300基因的功能和调控机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为普通小麦品种矮抗58。

1.2 试验方法

本试验于中国农业科学院国家小麦改良中心完成，采用盆栽法进行小麦植株的培养，分别于两叶一心期、拔节期和抽穗期收集健壮小麦根、茎、叶，并进行液氮速冻。

1.2.1TraesCS7A02G543300基因的克隆 使用北京庄盟公司的Plant Total RNA Kit（ZP405）提取小麦总RNA，使用EX RT kit（gDNAremover）（ZR108）试剂盒逆转录为cDNA。根据Ensembl Plants 登录的TraesCS7A02G543300基因序列，设计基因组特异引物（表1）。根据WANG 等[21]所述的方法进行PCR反应。PCR 产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳分离后，回收纯化并进行测序。

表1 用于基因克隆及表达分析的引物

1.2.2 TraesCS7A02G543300 蛋白的生物信息学分析 利用NCBI-ORF finder 工具获取基因的开放阅读框[22]；用Expasy-ProtParam 进行蛋白质等电点、亲疏水性等基本的理化性质分析[23]；用NLS Mapper 预测核定位信号[24]；用Plant-mPLoc 预测蛋白质亚细胞定位[25]；用 SignalP 4.0 预测蛋白的信号肽[26]；用NetPhos 3.1 分析蛋白质序列潜在磷酸化位点[27]；用NPS-SOPMA 和SWISS-MODEL 分别对蛋白质的二级结构和三级结构进行预测[28-29]；利用DNAMAN 软件进行序列比对。

1.2.3TraesCS7A02G543300基因的表达分析 以1.2.1 获得的 cDNA 为模板，参考 WANG 等[30]所述的方法进行实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）（TaTubulin为内参基因，引物序列如表1 所示）。相对表达量的计算参考文献[30]进行。采用SPSS 25.0软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 TraesCS7A02G543300 基因的克隆

以1.2.1 得到的cDNA 为模板进行TraesCS7A02 G543300基因的扩增，电泳结果表明，在1 100 bp 左右有1 条明显的特异性条带（图1）；测序结果表明，TraesCS7A02G543300基因的cDNA全长为1084bp；ORF 分析结果表明，该序列包含一个990 bp 的开放阅读框，编码329 个氨基酸。

2.2 TraesCS7A02G543300 蛋白的生物信息学分析

TraesCS7A02G543300 蛋白理化性质分析表明，该蛋白分子式为C1540H2447N435O476S25，分子质量为35.473 5 ku，理论等电点为5.1，亲水系数为-0.182，脂溶系数为73.98，不稳定系数是57.3（＞40），预测该蛋白为稳定的酸性、亲水性蛋白。在氨基酸序列第47—57 位含有核定位信号序列PASRKKRVEGM，表明该蛋白定位于细胞核。SignalP 4.0 分析无信号肽，表明该蛋白不是分泌型蛋白。NetPhos 3.1 分析结果表明，该蛋白中有18 个氨基酸可能被磷酸化，其中，包含11 个丝氨酸、5 个苏氨酸和2 个酪氨酸。

通过NCBI 数据库对该蛋白进行了功能结构分析，结果表明，该蛋白包含1 个保守的碱性/螺旋-环- 螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）结构域。利用 BLAST 程序在 The Arabidopsis Information Re-source 数据库中进行比较分析，结果表明，与其相似度最高的3 个拟南芥蛋白分别为AtbHLH093（相似性 51.76%）、AtICE1/AtSCRM（相似性 31.61%）和AtSCRM2（相似性33.6%），这3 个蛋白同属于bHLH-LZs 亚家族，在拟南芥中参与了气孔的发育过程。氨基酸序列比对结果表明，TraesCS7A02G543300蛋白与拟南芥SPCH、FAMA、MUTE 的相似度较低，其氨基酸一致性分别为20.00%、11.81%和21.15%（图 2）。

TraesCS7A02G543300 蛋白的二级结构预测结果如图3 所示，其主要由α- 螺旋和无规则卷曲组成，分别占比47.72%和40.73%；此外，N 端以α-螺旋的形式存在，C 端以延伸链的形式存在。以AtbHLH093 为模型蛋白对TraesCS7A02G543300 进行了三维结构的建模，预测结果如图4 所示，TraesCS7A02G543300 蛋白具有典型的螺旋- 环-螺旋（HLH）结构。

2.3 TraesCS7A02G543300 基因的表达分析

RT-qPCR 结果表明（图5），TraesCS7A02G543300基因在小麦叶中表达量极显著高于根和茎；且在两叶一心期的表达量极显著高于拔节期和抽穗期，预测TraesCS7A02G543300基因在小麦的生长发育前期发挥主要作用。

3 结论与讨论

为进一步了解TraesCS7A02G543300基因在小麦中的功能，本研究对TraesCS7A02G543300基因进行了生物信息学分析，并研究了TraesCS7A02G543300基因在矮抗58 不同组织及不同发育时期的表达特性。结果表明，TraesCS7A02G543300基因包含的完整开放阅读框长度为990 bp，编码了329 个氨基酸。TraesCS7A02G543300 蛋白的亚细胞定位被预测位于细胞核，这与其作为转录因子的功能是一致的。TraesCS7A02G543300 蛋白包含1 个保守的b HLH 结构域，属于 bHLH-LZs 亚家族，与拟南芥中的AtICE1/SCRM 高度同源，因此，TraesCS7A02G 543300 的功能可能与拟南芥AtICE1/SCRM 类似[5]。TraesCS7A02G543300基因在小麦叶中的表达量显著高于其他组织，在两叶一心期的表达量明显高于其他时期，这与ICE1/SCRM等气孔发育调控因子在拟南芥等植物中的表达特性一致[5，13]。这些结果为TraesCS7A02G543300基因在小麦叶片中参与气孔的发育过程奠定了理论基础。

前人研究表明，ICE1/SCRM 能与SPCH、FAMA和MUTE 相互作用并影响气孔的形成[6]。本研究对TraesCS7A02G543300 蛋白的基本理化性质进行了预测分析，但关于其蛋白功能的研究相对粗浅。接下来可以利用酵母杂交等验证TraesCS7A02G543300是否能与SPCH、FAMA 和MUTE 形成二聚体，从而研究TraesCS7A02G543300基因在小麦中的功能。除了参与气孔发育过程外，ICE1/SCRM 和SCRM2还能参与植物的逆境响应过程，过表达SCRM 能够增强水稻的耐逆性[31]。因此，下一步可分析TraesCS7A02G543300基因在逆境胁迫下的表达量，从而验证TraesCS7A02G543300基因是否参与了小麦的逆境响应过程。但由于单子叶植物气孔结构及气孔调控机制的差异，TraesCS7A02G543300基因的功能在小麦中是否有功能特化等还需进一步验证。