胎盘lncRNA H19/miR-675/PPARα与非妊娠期糖尿病巨大儿发生的关系

丁苗苗，倪丽芳，郑添，俞秋嫣，王玉环，杨新军

1.温州医科大学 公共卫生与管理学院 预防医学系，浙江 温州 325035；2.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 产科，浙江 温州 325027

巨大儿（macrosomia）是指任何孕周出生体质量≥4 000 g的新生儿[1]。近年来，我国巨大儿的发生率呈上升趋势，从2006年的6.5%增加到2016年的7.46%[2-3]，部分地区已达到9.2%[4]。分娩巨大儿不仅会增加产妇发生肩难产、产后出血、阴道撕裂等并发症的风险[5]，还会增加巨大儿成年后罹患肥胖、糖尿病、心血管疾病等的风险[6]。近年来关于妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）巨大儿的研究较多，且结论较为一致，而非GDM巨大儿发生原因和机制尚不明确。

lncRNA H19是序列长度大于200 nt不编码蛋白质的长链非编码RNA，可通过其第一个外显子区域加工产生的衍生物miR-675发挥作用，呈胎盘特异性高表达，是胎盘和胎儿生长发育的关键调控基因[7-8]。lncRNA H19/miR-675可调节胎盘生长和滋养层细胞增殖[8-9]，但是否参与非GDM巨大儿的发生发展仍不清楚。我们前期研究发现，过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferator activated receptor alpha，PPARα）在非GDM巨大儿胎盘中表达增加[10]，且有研究报道PPARα可受lncRNA H19/miR-675的靶向调控[11]，因此本研究假设胎盘lncRNA H19/miR-675/PPARα与非GDM巨大儿之间存在一定关系，通过人群研究和细胞实验两个角度对其进行探讨。

1 对象和方法

1.1 对象 基于2014—2016年在温州医科大学附属第二医院育英儿童医院产科建立的孕妇-新生儿队列，采用巢氏病例对照研究设计，病例组（巨大儿组）为出生体质量≥4 000 g的新生儿，对照组为随机选择的出生体质量2 500～3 999 g，且与巨大儿分娩时间相差3 d以内的新生儿。入选标准：正常妊娠、单胎、足月分娩，糖耐量试验正常。排除标准：有妊娠合并症者（高血压、心脏病、肝脏疾病等），有妊娠并发症（如胎盘异常、胎膜早破、先兆子痫等），新生儿先天畸形。本研究经温州医科大学伦理委员会批准，所有产妇均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 一般资料收集：采用自行设计的调查问卷收集产妇和新生儿的基本信息，包括产妇年龄、身高、孕前体质量、孕期体质量增加、分娩方式，新生儿性别、出生体质量及其他相关信息。

1.2.2 胎盘样品采集和处理：胎盘娩出后，立即无菌操作取胎盘母体面的滋养层组织1 cm3，放入加有RNAlater（美国Ambion公司）的DEPC处理过的冻存管中，4 ℃保存。采集的样品液氮运输，并保存于-80 ℃冰箱待检测分析。

1.2.3 细胞培养和转染：人绒毛膜滋养层细胞（HTR-8/SVneo）使用含有10%胎牛血清的DMEM培养基，并于37 ℃，5% CO2培养箱孵育。细胞按 lipofectamine 3000说明书的步骤转染。所用的si-H19序列：5’-CCGUCCCUUCUGAAUUUATT-3’，si-NC序 列：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，miR-675-mimic 序列：5’-UGGUGCGGAGAGGGCCCACAGUG-3’，mimic-NC序列：5’-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3’。

1.2.4 胎盘lncRNA H19、miR-675和PPARα的mRNA水平检测：用TRIzol法提取胎盘及细胞总RNA，反转录后进行qPCR检测胎盘lncRNA H19、miR-675和PPARα的mRNA表达水平，lncRNA H19、PPARα以GAPDH作为内参基因，miR-675以U6作为内参基因。所用引物序列lncRNA H19上游：5’-GGACGTGACAAGCA GGACAT-3’，下游：5’-CATAGTGTGCCGACTCCGTG-3’，产物片段长度为148 bp；PPARα上游：5’-CTATCATTTGC TGTGGAGATCG-3’，下游：5’-AAGATATCGTCCGGGTGGT T-3’，产物片段长度为121 bp。GAPDH上游：5’-CAGGA GGCATTGCTGATGAT-3’，下游：5’-GAAGGCTGGGGCTCATT T-3’，产物片段长度为138 bp。miR-675、U6的反转录和qPCR引物均购自广州市锐博生物科技有限公司。qPCR反应条件为：95℃ 30s，95℃ 5s，60 ℃ 30s，共40个循环。用2-△△Ct法计算基因的相对表达量。

1.2.5 Western blot分析：在细胞转染24～48 h后提取HTR-8/SVneo细胞的蛋白质，BCA法测定蛋白质浓度，金属浴100 ℃、5 min变性蛋白质。取等量蛋白质进行SDS-PAGE，将蛋白质转移到PVDF膜，用10%脱脂牛奶室温封闭2 h，TBST漂洗10 min×3次，PPARα抗体4 ℃摇床孵育过夜，再经TBST漂洗10 min×3次，用二抗（1:5 000稀释）室温孵育1 h，TBST漂洗10 min×3次。用化学发光法Bio-Rad凝胶成像系统进行检测，蛋白质条带的密度由Quantity One（美国Bio-Rad公司）定量。用GAPDH蛋白进行标准化，检测细胞总蛋白质中PPARα的表达水平。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS22.0软件进行数据分析。计量资料若呈正态分布以±s表示，组间比较采用成组t检验；非正态分布以M（P25，P75）表示，采用Mann-WhitneyU检验。计数资料采用例数和百分比表示，组间比较用χ2检验或秩和检验。采用logistic回归分析巨大儿的影响因素，以OR（95%CI）表示各因素对巨大儿发生的危险程度。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 共收集巨大儿55例，对照组58例。两组间孕前体质量、孕前BMI、孕期体质量增加、孕周、分娩方式、胎儿性别的差异有统计学意义（P＜0.05），产妇年龄、身高、初产妇的比例、巨大儿史在两组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两组产妇及新生儿的基线资料比较

2.2 胎盘lncRNA H19、miR-675、PPARα的mRNA表达水平 巨大儿组胎盘lncRNA H19和miR-675的表达量低于对照组，PPARα的表达量高于对照组，差异均有统计学意义[lncRNA H19：0.89（0.63，1.06）vs.0.97 （0.84，1.30），P＜0.01；miR-675：0.79（0.44，1.05）vs.0.98（0.63，1.47），P＜0.05；PPARα：1.45（1.01，1.92）vs.1.06（0.76，1.44），P＜0.01]，见图1。

图1 两组胎盘lncRNA H19、miR-675、PPARα的mRNA表达水平比较

2.3 胎盘lncRNA H19、miR-675和PPARα表达与非GDM巨大儿发生的关系 考虑潜在影响lncRNA H19、miR-675和PPARα表达差异的混杂因素，采用多因素logistic回归分析上述三种基因的胎盘表达水平与非GDM巨大儿的关系。在校正孕前BMI、新生儿性别变量后，胎盘lncRNA H19、miR-675和PPARα的mRNA表达仍与非GDM巨大儿的发生风险相关联，即胎盘lncRNA H19和miR-675的低表达及PPARα高表达均可增加非GDM巨大儿发生的风险，见表2。

表2 胎盘lncRNA H19、miR-675和PPARα的mRNA表达水平与非GDM巨大儿的关系

2.4 细胞水平验证lncRNA H19/miR-675对PPARα的调控作用 在人绒毛膜滋养层细胞（HTR-8/SVneo）中用siRNA敲低lncRNA H19，结果显示miR-675表达下调，PPARα的mRNA和蛋白表达水平上调，见图2A-D。 然而，在HTR-8/SVneo细胞中敲低lncRNA H19，同时过表达miR-675，则PPARα的表达上调被抑制，mRNA和蛋白表达水平与对照组比差异无统计学意义 （P＞0.05），见图2E-H。

3 讨论

本研究分析发现，孕前高BMI和男性新生儿可增加非GDM巨大儿的发生风险，与以往的研究[12]结果一致。此外，在非GDM巨大儿组中孕期体质量增加、孕周高于对照组且差异有统计学意义，表明这些也是影响非GDM巨大儿发生的重要因素。

本研究显示，在非GDM巨大儿的胎盘组织中lncRNA H19表达水平低于对照组，调整了潜在的混杂因素后，发现胎盘lncRNA H19低表达可增加非GDM巨大儿的发生风险，此研究结果与JIANG等[13]和刘小霄等[14]的报道一致。lncRNA H19是一种父系印迹、母系表达的印记基因，具有限制胚胎发育和减缓子代生长速度的功能[15]，因此当胎盘lncRNA H19表达下调时，可导致胚胎过度发育、加快胎儿的生长速度，从而促进巨大儿的发生发展。有研究报道，lncRNA H19是miR-675的主要前体物[16]，它的第一个外显子区域加工后可产生miR-675，且胎盘lncRNA H19可通过核糖核酸结合蛋白HuR动态调节miR-675的加工过程，从而影响miR-675的表达，也可进一步通过miR-675发挥其生物学功能[8]。在本研究中，miR-675在非GDM巨大儿的胎盘组织中呈低表达（与对照组相比），可增加非GDM巨大儿的发生风险，此结果与lncRNA H19一致，因此，可以认为胎盘lncRNA H19/miR-675参与了非GDM巨大儿的发生发展。

与对照组比：aP＜0.01图2 lncRNA H19/miR-675在HTR-8/SVneo细胞水平可调控PPARα的表达

PPARα是过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator activated receptors，PPARs）家族成员之一，在调节脂肪酸转运、脂肪酸氧化中发挥重要作用[17]。我们前期研究发现，非GDM巨大儿胎盘组织中PPARα表达增加。进一步通过TargetScan和MiRanda两种工具，我们发现PPARα是miR-675潜在的靶基因。本研究在校正了孕前BMI、新生儿性别等混杂因素后，发现胎盘PPARα高表达仍可增加非GDM巨大儿的发生风险，且有研究报道在肝脏和心脏组织中PPARα的表达可受lncRNA H19/miR-675的靶向负调控[11，18]，因此在非GDM巨大儿胎盘组织中PPARα的高表达可能部分受lncRNA H19/miR-675低表达的影响。本研究通过构建体外细胞模型，发现在人绒毛膜滋养层细胞（HTR-8/SVneo）中lncRNA H19/miR-675可调控PPARα的表达。综上，胎盘lncRNA H19/miR-675/PPARα通路可能参与了非GDM巨大儿的发生发展。

本团队前期研究发现非GDM巨大儿胎盘中脂肪酸转位酶（FAT/CD36）和膜脂肪酸结合蛋白（FABPpm）等脂肪酸转运相关的蛋白表达与PPARα一致增 加[19-20]，并与PPARα的表达水平成正相关[10]。研究报道PPARα可通过结合下游靶基因的PPRE元件从而增强脂肪酸转运相关基因的转录[21]，但在非GDM巨大儿胎盘中PPARα是否调控FAT/CD36和FABPpm的表达并影响了脂肪酸转运仍然不清楚，其具体机制以及PPARα在非GDM巨大儿中的临床意义需进一步深入研究。

综上所述，胎盘lncRNA H19/miR-675表达下调，可增加非GDM巨大儿的发生风险。此外，胎盘PPARα表达上调，部分受lncRNA H19/miR-675的调控，胎盘lncRNA H19/miR-675/PPARα与非GDM巨大儿的发生存在一定关系。