湿热瘀黄证慢加急性肝衰竭患者肠道菌群特征及预后分析*

李春青 过建春 荀运浩 王薇薇 石伟珍

杭州市西溪医院 (浙江 杭州， 310023)

在我国慢加急性肝衰竭多由慢性乙型病毒性肝炎或肝硬化发展而来，临床治疗难度大，病死率高，严重危害人类健康。根据其临床表现，可归属于中医学“黄疸”、“瘟黄”、“急黄”范畴。综观各医家文献，本病病机复杂，但总不外“瘀、毒、湿、热”诸端。我们前期的研究发现慢加急性肝衰竭中医证型主要以“瘀热、湿热”为主[1]。近年来肠道菌群失调、肠黏膜屏障功能受损在肝衰竭发病过程中备受关注。慢性重型肝炎患者存在严重肠道微生态改变[2,3]，肠道菌群可能在慢加急性肝衰竭患者的病情发展中起着非常重要的作用。因此本研究通过16S rRNA测序技术明确肠道菌群在湿热瘀黄证慢加急性肝衰竭患者中的分布特征及肠道菌群结构，初步探讨肠道菌群分布特征与其预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年6月至2019年8月在我院住院的湿热瘀黄证慢加急性肝衰竭患者37例，均符合纳入标准，患者入组前签署知情同意书，研究方案经杭州市西溪医院伦理委员会批准，获得患者知情同意后留取大便标本。所有患者在采样前2周内均未接受过抗生素治疗，其中男28例，女9例，年龄20～64岁，平均(51.28±11.32)岁。对入组患者随访24周，24周时好转组患者24例，男20例，女4例，平均年龄(50.79±11.21)岁；无好转组患者13例，男8例，女5例，平均年龄(52.08±11.93)岁。

1.2 诊断标准 ①西医诊断标准：慢加急性肝衰竭诊断标准参照2015年《慢性乙型肝炎防治指南》及2012年《肝衰竭诊疗指南》的诊断标准[4，5]。②中医湿热瘀黄证辨证标准。主症：a.起病急骤，身目俱黄，尿黄不利或自利；b.皮肤瘙痒，胃脘痞满，或口苦泛恶；c.舌苔黄腻或舌质紫暗、有瘀斑瘀点，舌下脉络增粗延长。次症：a.口渴但饮水不多；b.大便不调或秘结；c.鼻齿衄血，或皮肤瘀斑；d.胁下痞块；e.少苔或舌苔薄白或薄黄，脉弦或弦滑或弦数。辨证要求：凡具备主症3项，或主症2项加次症2项，脉象基本符合，可定为本证。

1.3 纳入标准 ①同时符合西医及中医诊断标准的患者；②自愿参加本研究并签署知情同意书者；③年龄16～65岁。

1.4 排除标准 ①急性肝衰竭、慢性肝衰竭患者；②其他病因(包括自身免疫性、药物性、酒精性、中毒性、寄生虫性)导致的慢加急性(亚急性)肝衰竭患者；③原发性肝癌患者；④抗HIV阳性者，合并甲、丙、丁、戊型肝炎病毒或巨细胞病毒、EB病毒等其他嗜肝病毒感染者；⑤入组时即合并中度脑水肿、严重感染(包括感染性休克、深部真菌感染、2部位以上感染、二重感染等)、Ⅰ型肝肾综合征、消化道大出血等患者；⑥采样前2周内使用生素或微生态调节剂患者；⑦胆囊切除或消化道手术史、脾切除史患者；合并有心、脑、肾、血液系统等脏器功能严重损伤者及精神病患者；⑧妊娠或哺乳期妇女；⑨不愿合作及依从性差的患者。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 临床指标及治疗观察 对所有入组患者检测肝功能、凝血功能、乙肝三系、血氨、腹部超声等，依据临床经验及指南等进行规范化治疗，并观察至24周。

1.5.2 预后判断及分组方法 以入组24周时状况或死亡为终点进行分组。好转组：①临床症状明显好转，肝性脑病消失；②黄疸、腹水等体征明显好转；③肝功能指标明显好转(TBil降至正常的5倍以下，PTA>40%)；其他均归为无好转组。

1.6 标本采集及检测 收集入组患者的粪便，置于-80℃冰箱中保存，统一提取样本DNA。琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性，Nanodrop 2000检测基因组DNA质量，对于合格的样本检测区域进行高保真PCR扩增，利用带有Index序列的引物，通过高保真PCR向文库末端引入特异性标签序列。扩增后产物琼脂糖凝胶电泳检测，应用核酸纯化磁珠对扩增产物进行纯化，得到一个样本的原始文库。对已经带有各自Index标签的样本文库浓度进行适当稀释，后利用Qubit对文库进行精确定量，根据不同样本的测序通量要求，按相应比例(摩尔比)混合样本，通过Agilent 2100 Bioanalyzer检测测序文库插入片段的大小，确认在120～200 bp之间无非特异性扩增，并准确定量测序文库浓度，采用Miseq平台，2×250 bp的双端测序策略对文库进行测序，后续进行生物信息学分析。

1.7 生物信息学分析 采用 Mothur、R对可操作分类单元(OTUs)进行Alpha多样性分析和Beta多样性分析。组间样品菌群差异性分析采用Lefse方法，LDA score(log 10)>2的物种被认为具有显著性差异。

1.8 统计学方法 应用SPSS 23.0统计学软件进行分析,对分组样本的群落结构以及物种组成进行差异显著性检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 群落组成分析

2.1.1 多样本物种组成柱状图 在门的水平上，厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes) 为优势菌群，另外丰度较高的菌群还有变形菌门(Proteobacteria)，放线菌门 (Actinobacteria)。门水平下两组样本肠道菌群的组成情况见图1。在属的水平上(图2)丰度较高的为拟杆菌属(Bacteroides)、肠球菌属(Enterococcus)、乳酸菌属(Lactobacillus)、克雷伯菌属(Klebsiella)、大肠杆菌志贺菌(Escherichia/Shigella)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、普雷沃菌属(Prevotella)。

图1 在门水平上的菌群相对分布情况柱形图

图2 在属水平上的菌群相对分布情况柱形图

2.1.2 Metastats分析 通过Metastats分析对组间样本进行比较，在各分类水平上找出两组中具有显著差异的物种，以P<0.05作为差异显著性筛选阈值，对于组间丰度显著差异的物种绘制箱体图，见表3、表4。

2.2 Alpha多样性分析 多样性指数差异分析：基于各样本的多样性指数，可以检验组间样本的Alpha多样性是否存在显著差异。基于Wilcoxon秩和检验对组间多样性指数进行差异分析，以P<0.05作为差异显著性筛选阈值，并使用 Bonferroni方法对P值进行多重假设检验校正，用以评估组间物种多样性是否存在显著差异。Alpha多样性分析表明，两组的Chao1指数(P=0.718)、Ace 指数(P=1)、Shannon指数(P=0.987)和Simpson指数(P=0.913)均没有统计学差异。好转组和无好转组患者的肠道菌群Alpha多样性没有明显差异。

2.3 Beta多样性分析

2.3.1 Venn图 基于OTU丰度表,以分组为单位,Venn图可以筛选每组样本中特有的OTU，以及组间共有的OTU[6]，并进行可视化展示。由图5可以看出，慢加急性肝衰竭好转组患者肠道菌群OTU为1 156种，而无好转组患者肠道菌群OTU为905种，好转组患者肠道菌群物种数量多于无好转组。

图3 在门、纲、属水平上差异物种比较箱图

图4 在目、科水平上差异物种比较箱图

图5 两组患者的肠道菌群间共有与特有的OUT

2.3.2 Lefse分析 Lefse分析可用于筛选最可能解释组间差异的物种 在以上分析的基础上，进一步的Lefse分析显示了两组肠道菌群在各个物种层次的特性分布差异(图6)。可以看出两组间样品肠道菌群在多个分类学水平都有比较大的差异。根据LAD SCORE大小，好转组患者粪便微生物群落优势菌群有普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、干酪乳杆菌Zhang (Lactobacillus Casei Zhang)、梭状杆菌(Clostridium)，Pseudoflavonifractor、罗斯氏菌属(Roseburia)等，而无好转组患者中鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、异单胞菌科(Alteromonadaceae)、假交替单胞菌科(Pseudoalteromonadaceae)、肠杆菌科(enterobacteriaceae)、嗜盐单胞菌科(Halomonadaceae)、海洋螺菌科(Oceanospirillaceae)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)的相对菌群丰度高于好转组(P<0.05)。

图6 好转组和无好转组患者肠道菌群Lefse分析

3 讨论

肠道微生态系统是人体最大的微生态系统，由3个部分组成：肠道菌群、肠上皮细胞、肠道黏膜免疫系统[7]。肠道菌群构成复杂，细菌种类繁多，其菌种达到1 000多种，总数达100万亿，是人体自身细胞总数的10倍[8]。肠道微生物相互依存、制约，在维持人体营养、代谢、免疫、防御、肠道微生态平衡等方面发挥着重要作用，越来越多的研究表明肠道菌群与人类疾病的发生发展有着密切的关系。Round等[9]发现疾病状态下会导致肠道中共生的细菌数量减少，而致病菌的数量会增加，肠道菌群结构的改变在另一方面又会加重病情进展，由于对肠-肝轴认识的逐步深入，肠道细菌易位、免疫功能障碍和肝脏炎症反应是慢加急性肝衰竭的主要发病机制[10]，肠道菌群失调在肝衰竭发病过程中起着重要作用。慢加急性肝衰竭病情重，并发症多，病死率高，准确判断病情的预后对临床选择治疗手段尤为重要，但慢加急性肝衰竭患者的肠道菌群特征与其预后关系的相关研究较少。

我们前期的研究显示，湿热瘀黄证是慢加急性肝衰竭的主要证型，本研究主要分析湿热瘀黄证慢加急性肝衰竭患者肠道菌群特征。通过16S r DNA基因检测分析得出，在门分类水平上，患者肠道菌群以厚壁菌门和拟杆菌门两个优势菌群为主，这与近年来的相关研究结果相符[11，12]。虽然本研究中两组间肠道菌群Alpha多样性没有明显差异，但是相对于好转组，无好转组患者肠道菌群物种数减少，慢加急性肝衰竭患者无好转组菌群的改变还表现在其组成结构上的差异。在门水平上，在肠道中占有重要作用的优势菌厚壁菌门所占的比例显著减少，然而变形菌门所占的比例却明显增多。已有研究发现[13]，在肝衰竭患者的肠道内都有低厚壁菌门的现象。本研究发现好转组患者厚壁菌门相对丰度显著高于无好转组，厚壁菌门含量减少可能与慢加急性肝衰竭患者的病情加重有关。另外在属水平上好转组患者十八梭菌属相对丰度高于无好转组，国内有小样本的研究显示肝衰竭患者肠道内梭杆菌属消失[14]，具体原因尚不明确。

在研究中我们还发现好转组患者巴斯德菌科相对丰度高于无好转组，Chen等[15]的研究中发现特定的细菌与慢加急性肝衰竭的炎症因子相关，巴斯德菌科与MELD指数相关，能独立预测患者的预后，提示肠道菌群失调与慢加急性肝衰竭的死亡率相关。另一项研究显示肝硬化失代偿和发生慢加急性肝衰竭且死亡的患者存在更为严重的肠道菌群紊乱，说明肠道菌群在慢加急性肝衰竭中的意义[16]。Li等[17]的研究也显示慢性重型肝炎患者肠道微生态严重失衡，肠道微生态失衡程度与肝炎病情严重程度有关，由此可以看出慢加急性肝衰竭病情进展与其肠道菌群有着密切联系，肠道菌群在预测病情转归及预后方面有着重要的价值。

慢加急性肝衰竭患者肠道菌群失调主要是菌群的整体多样性与丰度明显减少[18]，且肠道菌群失调是病情加重的重要因素，因此，改善肠道菌群失调有助于延缓或防止肝衰竭进展。具有高多样性的肠道菌群可能对病情的恢复极其有意义，而低多样性的肠道菌群可能会促进慢加急性肝衰竭病情的进展。因此当机体处于病理状态时及时调整肠道菌群，维持其平衡与稳定状态对病情的好转有着重要的作用。

肠道微生物在肝衰竭的发生发展中起到重要的作用，通过分析各组粪便的物种丰度、物种多样性的增减，菌群结构的变化，深入肝衰竭肠道微生态的研究，阐明肝衰竭预后与肠道菌群特征的关系，有助于尽早发现疾病发展趋势。本研究初步探讨了肠道菌群在预测慢加急性肝衰竭患者预后中的价值，但由于客观原因我们仅研究了湿热瘀黄证慢加急性肝衰竭患者，且入组患者偏少，需扩大样本量进行多证型间的横向比较分析。明确肝衰竭发展趋势及预后有助于选择适当的治疗方法防止病情进展，今后应深入研究肠道菌群及其代谢产物在肝衰竭发病中的作用机制，开展研究以肠道菌群为靶点的治疗方法的安全性和有效性，为慢加急性肝衰竭的防治提供可靠依据。