基于响应面法对抗肿瘤乳酸菌培养条件的优化

◎靳瑾健，丁 琳，郭 皓

（1.黑龙江省农垦齐齐哈尔管理局中心医院药剂科，黑龙江 齐齐哈尔 161000；2.齐齐哈尔医学院科研处，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

乳酸菌是能利用碳水化合物发酵产生大量乳酸的一类细菌[1]，研究表明一些乳酸菌可以调节机体胃肠道微生态平衡，增强免疫力，降低胆固醇，抗氧化抗肿瘤等[2]，因此常被用作功能性食品成分。随着人们健康意识及安全意识的提高，将高效、低毒的乳酸菌作为天然制剂开发已成为研究热点。目前，乳酸菌的抗肿瘤作用机制研究主要集中于阻断自由基链的传递过程，阻断自由基的产生，从而抑制肿瘤发生发展[3]。FUKUI[4]等研究发现乳酸菌可明显降低肿瘤细胞的发生率。AZAM[5]等研究发现乳酸菌培养的上清液可抑制乳腺癌细胞相关基因的表达，由此可见，有些乳酸菌不但本身有抗肿瘤的作用，其代谢产物也具有抗肿瘤的功能[6]。因此本研究选取乳酸菌代谢产物为研究对象，通过单因素试验和响应曲面分析方法优化培养条件，以观察其抗肿瘤活性，为乳酸菌的开发利用提供理论依据，为生产功能性乳制品研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳酸菌G5（本实验室分离得到的一株活性乳酸菌）；MTT（美国Amersco 公司）、DMEM 培养基（美国Gibco 公司）、酶标仪（F-4500，瑞士Tecan 公司）、大容量高速冷冻离心机（Z36HK，德国Hermle 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸菌的培养

取甘油保藏的乳酸菌菌株接种于MRS 培养基中，30 ℃、120 r·min-1培养48 h，活化3 代后，用于后续试验。

1.2.2 细胞抗肿瘤实验

乳酸菌抗肿瘤实验采用MTT 实验的肿瘤抑制率为指标进行筛选。人乳腺癌细胞MCF-7 接种于96 孔板，乳酸菌代谢产物作用48 h，培养结束每孔加20 μL MTT溶液，孵育3 h 后离心去上清，加150 μL 二甲基亚砜（DMSO），置摇床上低速振荡10 min 后，利用酶标仪570 nm 检测波长检测各组吸光度并计算细胞的抑制率。抑制率=（1-实验组吸光度/对照组吸光度）×100%。

1.2.3 单因素试验

采用单因素试验初步探究抗肿瘤乳酸菌的培养条件，研究蛋白胨添加量（5 g·L-1、10 g·L-1、15 g·L-1、20 g·L-1和25 g·L-1）、葡萄糖添加量（10·L-1、20·L-1、30·L-1、40·L-1和50 g·L-1）、接种量（1%、3%、5%、7%和10%）、培养温度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃和42 ℃）、培养时间（24 h、32 h、48 h、60 h 和72 h）及培养基pH（5.5、6.0、6.5、7.0 和7.5）对肿瘤细胞抑制率的影响。

1.2.4 Plackett-Burman 试验设计

根据单因素的试验结果，选择影响乳酸菌培养的6 个因素（蛋白胨添加量、葡萄糖添加量、接种量、培养温度、培养时间和培养基pH）作为评价因素，以肿瘤细胞抑制率Y作为响应值，应用Design-Expert 8.0软件设计Plackett-Burman（PB）试验。

1.2.5 Box-Behnken 试验设计

根据PB 试验结果，选择显著影响乳酸菌培养的3 个因素（蛋白胨添加量、培养基pH、培养时间）作为自变量，以肿瘤细胞抑制率Y作为响应值，应用Design-Expert 8.0 软件设计进行Box-Behnken（BBD）试验。

1.3 统计分析

响应面试验设计使用Design Expert 8.0；统计分析使用SPSS 19.0。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

各因素对肿瘤细胞抑制率的影响见表1。根据单因素试验结果，选择蛋白添加量为15 g·L-1，葡萄糖添加量为30 g·L-1，接种量为5%，选择培养温度为37 ℃，培养时间为48 h，最适培养基pH 为6.5。

表1 单因素试验结果表

2.2 PB 试验分析

单因素试验的基础上，PB 试验设计及结果见表2，回归分析结果见表3。

表2 Plackett-Burman 试验设计及结果表

表3 Plackett-Burman 试验回归分析结果表

由表3 可知，模型的F值为9.77，P 值为0.012 1（P＜0.05），模型项显著，表明该模型具有重要意义。该模型的决定系数R2=0.921 4，信噪比=10.525 2（＞4），表示此模型具有良好的预测能力。各个变量对肿瘤细胞抑制率影响的显著程度依次为F ＞D ＞A ＞C ＞E ＞B，利用软件对表3 的数据进行分析，得到模型拟合方程：Y=37.37+3.51A-0.875 0B+1.71C+5.45D+1.45E+6.15F，由回归方程可知，培养基pH、培养时间和蛋白胨添加量3 个因素显著地影响肿瘤细胞的抑制率，因此选择这3 个因素进行BBD 试验。

2.3 BBD 试验分析

在PB 试验的基础上，BBD 试验设计水平结果见表4，回归分析见表5。

表4 Box-Behnken 试验设计及结果表

表5 Box-Behnken 试验回归分析结果表

由表5 可知，回归模型F值为27.12，P=0.000 1（P＜0.05），模型差异极显著，该模型的决定系数R2=0.972 1，信噪比=14.622（＞4），表明此模型具有很强的预测能力。模型失拟项无显著性差异（P=0.283 1 ＞0.05），说明该模型的拟合度较好，由此可以判断，BBD 试验设计是可靠的。利用软件对表4 的数据进行分析，得到模型拟合方程：Y=48.38+2.22A+3.56D+3.25F+1.59AD-0.50AF-1.97DF-6.77A2-6.83D2-4.35F2。各因素之间的交互作用对肿瘤细胞抑制率的影响如图1所示。

图1 各因素变化对肿瘤细胞抑制率的交互作用图

2.4 验证试验

由BBD 试验可得出，抗肿瘤乳酸菌最佳培养条件是蛋白胨添加量为20.90 g·L-1，培养时间为38.34 h，培养基pH 为6.65，在此条件下，预测的肿瘤细胞抑制率实际值为49.50%，根据实际情况对其进行调整，培养条件是蛋白胨添加量为20 g·L-1，培养时间为38 h，培养基pH 为6.7，测出的实际肿瘤细胞抑制率为46.54%，与预测值无显著差异（P＞0.05）。

3 结论

本试验以乳酸菌代谢产物抑制肿瘤细胞生长为指标，从中优化乳酸菌的培养条件。通过单因素试验分析和响应面试验优化，得到最佳的培养条件：蛋白胨添加量为20 g·L-1，培养时间为38 h，培养基pH 为6.7，对肿瘤细胞的抑制率达到了46.54%，此研究为乳酸菌代谢产物抗肿瘤的应用提供了理论依据，使乳酸菌的应用前景愈加广阔。