响应面法优化酶解制备鱼皮胶原寡肽

◎王 霞，毕桂灿，赖园园

（1.广东食品药品职业学院 生物技术学院，广东 广州 510000；2.华南农业大学新能源与新材料研究所，广东 广州 510000；3.安徽国肽生物科技有限公司，安徽 宣城 242000）

胶原蛋白是人体内一种重要的结构蛋白，广泛分布于皮肤、骨、韧带等组织中[1]。胶原蛋白分子具有独特的三股螺旋结构[2]，分子量大难以被人体吸收。胶原寡肽是将胶原蛋白进行水解后得到的小分子产物，易被人体吸收，具有抗氧化、美容、降血压等功效，在化妆品、食品工业、医学材料等领域的应用日益广泛[3]。胶原蛋白水解主要有化学法和酶解法，化学法对寡肽结构和氨基酸破坏严重，导致产物活性低，污染严重；酶解法反应过程温和，对胶原肽结构没有被破坏，极大地保留了产物的活性[4]。本研究以鲮鱼鱼皮为原料，采用SCAU 胶原蛋白复合酶水解制备胶原寡肽，并通过单因素和响应面试验优化其酶解反应条件，为鱼皮酶解制备胶原肽提供一定的技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SCAU 胶原蛋白复合酶和鲮鱼鱼皮，由华南农业大学生物质工程研究所提供。NaOH、HCl、甲醛均为分析纯，活性炭为食品级。鱼皮洗净，刮去鱼皮表面鱼鳞和脂肪，剪成小块，于50 ℃烘箱烘干，保存于-20 ℃下备用。

1.2 仪器与设备

D1型自动蒸汽灭菌锅，BT1248 分析天平，1810D型自动双重纯水蒸馏器，XMT-DA 水浴锅。

1.3 实验方法

1.3.1 酶解制备胶原寡肽

称取2 g 干鱼皮，121 ℃高压灭菌15 min，按料液比1∶9（g∶mL）加入无菌水，调节pH 值，加入SCAU 胶原蛋白复合酶液于水浴锅中水解数小时后，加入0.2 g 活性炭粉于沸水浴中保温5 min 终止酶解，冷却至室温，抽滤，滤液冷冻干燥后得胶原寡肽粉。反应条件根据单因素实验进行调整。

1.3.2 提取率的计算

称量冷冻干燥后的胶原寡肽粉质量，胶原寡肽提取率计算公式为：

1.3.3 酶解制备鱼皮胶原寡肽单因素试验

根据预实验，选择加酶量（0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL 和1.0 mL）、时间（2 h、3 h、4 h、5 h 和6 h）、温度（45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃和65 ℃）、pH 值（6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0）作为因素，分别测定4 个因素对鱼皮胶原肽提取率的影响。

1.4 响应面实验设计

采用Box-Behnken 试验设计，将鱼皮胶原寡肽提取率设为响应值，得到4 因素3 水平试验设计模型如表1所示。

表1 Box-Behnken 试验因素及水平表

2 结果与分析

2.1 酶解制备胶原寡肽单因素试验

2.1.1 加酶量对胶原寡肽提取率的影响

加酶量对鱼皮胶原寡肽提取率的影响如图1所示。随着加酶量的增加，胶原寡肽提取率逐渐升高，当加酶量为0.6 mL 时胶原寡肽提取率最高，之后略有下降。原因可能是随着反应体系中酶浓度的升高，反而会抑制水解的进行，从而使肽提取率下降[5]。因此，选择加酶量0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL 作为研究水平。

图1 加酶量对胶原寡肽提取率的影响图

2.1.2 酶解时间对胶原寡肽提取率的影响

酶解时间对鱼皮胶原寡肽提取率的影响如图2所示。随着时间的增加，胶原寡肽提取率逐渐升高，至酶解时间为4 h 时提取率最高，继续增加酶解时间提取率基本上维持不变。原因可能是随着保温时间的延长，胶原蛋白酶的稳定性受到影响，活性逐渐丧失，无法再催化蛋白的水解[6]。因此，选择酶解时间3 h、4 h、5 h 作为研究水平。

图2 酶解时间对鱼皮胶原肽提取率的影响图

2.1.3 酶解温度对鱼皮胶原寡肽提取率的影响

酶解温度对鱼皮胶原寡肽提取率的影响如图3所示。当酶解温度为55 ℃时，寡肽提取率最高，酶解温度为65 ℃时寡肽提取率最低，原因可能是该胶原蛋白酶的最适温度约为55 ℃，温度偏低，不利于酶与底物的结合与反应；该胶原复合酶对高温较为敏感，温度过高，易导致酶变性失活，提取率下降。因此，选择50 ℃、55 ℃、60 ℃作为研究水平。

图3 酶解温度对鱼皮胶原肽提取率的影响图

2.1.4 pH 值对鱼皮胶原寡肽提取率的影响

pH 值对鱼皮胶原寡肽提取率的影响如图4所示。结果表明，当pH 值为8.0 时，寡肽提取率最高，pH值低于或者高于8，提取率都会下降。原因可能是该酶最适pH 约为8，当反应体系pH 值偏离最适pH 时，该胶原蛋白复合酶的活性都会显著降低，反应速度减慢。因此，选择pH 7.0、pH 8.0、pH 9.0 作为研究水平。

图4 pH 值对鱼皮胶原肽提取率的影响图

2.2 酶解制备鱼皮胶原寡肽结果与分析

2.2.1 酶解制备鱼皮胶原肽数学模型的建立与显著性检验

根据单因素试验结果，利用Design-Expert 12.0.1.0响应面软件进行组合设计，考查加酶量（A）、时间（B）、温度（C）、pH 值（D）对鱼皮胶原寡肽提取率（Y）的影响，试验组合及各组合下得到的胶原寡肽提取率结果见表2。

表2 试验设计及结果表

通过软件对表2 数据进行回归拟合分析，以鱼皮胶原寡肽提取率为目标函数的二次回归方程为：Y=21.95+0.342 5A+0.799 2B-0.393 3C+2.70D+0.190 0AB-0.020 0AC-0.552 5AD-0.087 5BC-0.075 0BD+0.052 5CD-1.86A2-2.26B2-2.65C2-5.20D2。对表2 数据进行显著性检验，结果见表3。

表3 显著性检验分析表

由表3 可知，此模型P值远小于0.01，说明此模型极显著，误差很小，故此模型可代替真实值对鱼皮胶原寡肽提取率进行分析。在回归模型中，对酶解制备鱼皮胶原寡肽影响为极显著的为一次项D，二次项B2、C2、D2，而一次项B 和二次项A2对酶解制备鱼皮胶原寡肽影响为显著。影响鱼皮胶原寡肽提取率大小因素依次为pH 值＞时间＞温度＞加酶量。

对该回归模型进行可信度分析，复相关系数R2=95.20%，修正相关系数R2Adj=90.41%，Y变异系数为6.14%，试验值与理论值相关性高，说明此模型可靠性高。

2.2.2 因素间相互作用响应面分析

响应面图能够反映出4 个因素之间的相互关系以及作用程度[7]，结果如图5所示。各响应曲面的最高点位于等高线最小椭圆的中心点或附近[8]，说明加酶量、时间、温度和pH 值各因素之间存在的相互作用不显著。

图5 鱼皮胶原寡肽提取响应面图

2.2.3 酶解制备鱼皮胶原肽参数优化

根据Design Expert12.0.1.0 软件的计算，最优酶解反应条件为：加酶量0.61 mL（即每克鱼皮（干）加酶0.305 mL）、酶解时间4.18 h、酶解温度54.62 ℃、pH 值8.25，鱼皮胶原寡肽提取率预测为22.39%。考虑到实际方便及易操作性，将酶解反应条件设定为：每克鱼皮（干）加酶0.305 mL、时间4.2 h、温度54.6 ℃、pH 值8.2。在此条件下进行3 次平行试验，酶解制备鱼皮胶原肽平均提取率为22.58%。

3 结论

本方法利用SCAU 胶原蛋白复合酶水解鲮鱼鱼皮提取胶原寡肽，并采用Box-Behnken 响应面法优化酶解反应条件参数。结果表明此鱼皮胶原蛋白酶解的最佳条件为每克鱼皮（干）加酶0.305 mL、酶解时间4.2 h、酶解温度54.6 ℃、pH 值8.2。在此酶解反应条件下进行3 次平行试验，鱼皮胶原肽提取率平均为22.58%。方差分析结果表明，影响鱼皮胶原寡肽提取率大小因素依次为pH 值、水解时间、水解温度和加酶量，交互项对鱼皮胶原肽提取率影响不显著。