适配体生物传感器检测食品中链霉素的研究进展

彭海帅，王毕妮，惠媛媛，张富新，刘玉芳，赵爱青，任 荣，贾 蓉

（陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安 710119）

因此，STR 在食品中的残留引起了各国高度重视。国际食品法典委员会（Codex Alimentarius Commission，CAC）规定在牛奶中最大残留限量（Maximum Residue Limit，MRL）为200 μg/kg，在鸡肉、猪肉中MRL 均是600 μg/kg[4]。2002年我国农业部《动物性食品中兽药最高残留限量》规定，牛奶中MRL 为200 μg/kg，畜禽肌肉中为600 μg/kg[5]。在这些标准的要求下，STR 的检测成为动物性食品和饲料中的研究热点。国内外已经报道的传统的STR 检测方法包括：亲水相互作用液相色谱法（ Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography，HILIC）[6−7]、酶联免疫法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）[8−9]、液相色谱-串联质法（Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）[10−13]等。虽然这些方法灵敏度高、重现性好，但是样品处理复杂、检测成本较高、且需专业人员操作，因而极大地限制了它们在STR 快速检测方面的应用。生物传感器作为一种快速检测技术，由识别元件（抗原、抗体、酶、适配体、微生物、细胞、组织等）、信号转导元件和信号放大元件三个部分[14]构成。识别元件中的适配体由于具有优良检测性能而被广泛用于生物传感器的构建中。随着光学、电化学技术的发展，基于适配体的光学、电化学生物传感器在食品检测行业应用广泛[15−16]。本文综述了近五年基于适配体的光学、电化学生物传感器在STR 检测中的研究进展，以期为STR 生物传感器的进一步发展提供参考与借鉴。

1 基于适配体的生物传感器

适配体（Aptamers，Apt）作为生物传感器识别元件之一，是通过指数富集的配基系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX）筛选出的单链寡核苷酸或肽（通常是DNA 或RNA），长度一般为25～60 个碱基[17]，分子质量约6～40 kDa，解离常数通常在纳摩尔至皮摩尔范围内，以A-T（A-U）、G-C 碱基对形成发夹、假结或凸环等二级结构[18]。具有与靶标分子（例如小的有机分子、多肽、蛋白质、离子等）特异性识别的能力，其原理与单克隆抗体类似：适配体和靶分子之间通过氢键、范德华力、碱基堆积等各种作用进行形状互补型识别[19]，但与抗体相比适配体具有更高的特异性与亲和力、易于通过化学合成和体外筛选获得、可结合的靶标物质的范围更宽、分子量小、具有良好的稳定性和可重复性的优势[20−21]。

以上优点使适配体广泛应用于构建生物传感器。基于适配体的生物传感器是利用适配体独特的立体结构与靶标分子特异性结合，通过信号传导元件将生物反应转变为光、电等可识别的信号，实现对靶标分子检测的生物传感技术。

2 基于适配体的光学生物传感器

将适配体传感器与光学检测技术结合形成的光学传感器具有操作简便、灵敏度高、响应快等优点[22]。根据反应机制不同，可为以下几类：基于适配体的化学发光传感器、基于适配体的荧光传感器、基于适配体的比色传感器等，在STR 快速检测中的应用如下（见表1）。

表1 链霉素光学适配体传感器Table 1 Streptomycin optical aptamer sensor

2.1 基于适配体的化学发光传感器

化学发光（Chemiluminescence，CL）的检测原理是：由于化学反应会产生大量能量，诱导电子从基态跃迁到激发电子态，同时能量以光辐射的形式释放出来，产生化学发光现象，在分析化学中具有背景噪声小、安全可控等优点。基于化学发光原理设计的适配体传感器具有装置成本低廉、不需要外部光源、检测线性范围较宽等优点[20,23−24]。Sun 等[25]基于适配体和G-四链体DNA 酶修饰的三维石墨烯复合材料，成功制备了CL 传感器用于检测STR。其中β-环糊精和离子液体功能化的氧化石墨烯气凝胶（β-CD/IL@GOGA）作为骨架时具有较大的比表面积，适配体（Apt）和G-四链体DNA 酶分别修饰在骨架上，当STR 存在时，由于STR 和Apt 之间的特异性识别，使G-四链体DNA 酶从骨架上释放出来，催化了鲁米诺-H2O2的CL 反应，实现了STR 的间接检测。该CL 传感器线性范围为1.4×10−12～2.8×10−9mol/L，检出限为9.2×10−14mol/L。

基于适配体CL 传感器有诸多优点但CL 检测强度容易受到检测系统中共存基质的干扰，强度也较弱，在选择灵敏性方面有待提升[25−26]。

2.2 基于适配体的荧光传感器

一些物质经过紫外光的照射后，原子被激发发生原子能级跃迁从而反射出各种可见光，使物质呈现荧光现象[14]。基于荧光现象的适配体传感器具有操作简单、选择性好、可以实时检测等独特优势[27]。荧光传感器（Fluorescent sensor）可以将分子识别信息转换成荧光信号，一般由荧光团（Fluorophore）通过连接基（Spacer）与受体（Receptor）相连而成。其中荧光团是一种信号传递物质，可将识别信息转换成光学信号[28]。Taghdisi 等[29]设计了一种基于核酸外切酶III （ExoIII）、SYBR Gold 和适配体互补链的荧光传感器，用于灵敏检测STR。在没有STR 的情况下，荧光强度较弱。加入STR 后，适配体与靶标（STR）结合，导致互补链从适配体中释放出来，加入SYBR Gold 后，荧光强度会增强。该传感器对STR 具有很高的选择性，检出限低至54.5 nmol/L。Emrani 等[30]设计了基于金纳米颗粒（AuNPs）和双链DNA（dsDNA）荧光猝灭适配体传感器，用于STR 快速检测。在不存在STR 的情况下，适配体和互补dsDNA（已被FAM 标记）的结合是稳定的，此时有强烈的荧光。当存在STR 时，适配体与靶标（STR）结合，使互补dsDNA 被释放出来并且吸附在AuNPs 的表面上，此时互补dsDNA 上的荧光会被AuNPs 淬灭。该方法的检出限为47.6 nmol/L。

荧光传感器可以快速、简便地检测目标物，但有些荧光团容易发生光漂白，影响发射强度，进而难以获得较低的检出限。另外有些荧光团存在毒性对细胞有害[31−33]。因此，仍需进一步提升荧光传感器的灵敏度和安全性。

周大伟和周小伟兄弟俩，周大伟在济南工作，每月寄给生活在临沂老家的父母1500元生活费；周小伟在农村老家，以种地为生，挣钱少，也不需要税前扣除，每月给父母500元生活费。周大伟可以每月税前扣除1500元甚至2000元吗？

2.3 基于适配体的比色传感器

比色法（Colorimetry）是通过比较或测量溶液对光选择性吸收而产生的可视化颜色来确定待测组分含量的方法，与其他检测方法（化学发光、荧光、电化学等）相比，仅需要用裸眼观察，不需要复杂的仪器，非常适合即时检测（Point-of-care testing,POCT）[34]，POCT 是一种在采样现场即刻进行分析，样本无需复杂处理的一类快速检测方法。近年来，智能手机的普及和生物传感器技术的进步促进了POCT 的发展[35]。目前POCT 比色传感器已广泛应用于食品安全、环境监测、医学研究等领域。

Luan 等[36]开发了POCT 适配体比色传感器，以多孔SiO2微珠-酶联聚合物（Power VisionTM，PV）作为比色探针，核酸外切酶辅助的靶标循环检测STR。在STR 和核酸外切酶I（Exo I）存在下，比色探针上的Apt 将捕获STR 形成复合物（STR/Apt-Au-PV），Exo I 消化STR/Apt-Au-PV 上的Apt，释放的STR 可以参与新的循环。此外，在PV 上标记大量辣根过氧化物酶（HRP）可以进一步高效催化H2O2-TMB（3,3,5,5 四甲基联苯胺）系统进行显色，然后通过紫外分光光度计进行检测。该方法的检出限是1 pg/mL，检测范围是0.003～20 ng/mL。Lin 等[37]通过智能手机的数字图像比色法建立了POCT 法快速检测STR。过量的适配体与互补DNA 杂交形成dsDNA，SYBR Green I 与dsDNA 结合后发出明显的绿色荧光。当STR 与适配体结合后，荧光强度会降低。在智能手机上安装Touch Color 应用程序，通过使用数字图像比色法读取图像的RGB 值，其中G 值和STR 浓度之间存在线性关系。该方法的检出限为94 nmol/L，线性范围是0.1～100 μmol/L。

基于适配体的POCT 比色传感技术有效地减小了检测设备的体积、降低了检测成本、缩短了检测时间[38]，但是目前基于智能手机POCT 生物传感器大多数仍处于概念阶段，要实现商业化还有很长的路要走[35]。

3 基于适配体的电化学生物传感器

基于适配体的电化学传感器通过生物识别元件（适配体）与目标物特异性结合，引起电极表面电化学信号变化，通过检测信号变化测定目标物含量[39−40]。该方法在STR 检测中的应用如下（见表2）。

表2 链霉素电化学适配体传感器Table 2 Streptomycin electrochemical aptamer sensor

贵金属纳米颗粒[41]、碳基纳米材料[42]、磁性纳米粒子[43]和量子点[44]、光敏材料等，可以增加传感器的电化学响应，实现信号放大策略。其中光敏材料会引起光电化学（Photoelectrochemistry,PEC）过程：光敏材料吸收光子后，经过电荷分离、电荷转移等过程，在传感界面形成电子-空穴对，产生了光子到电的转换，从而引起光电信号响应[45−46]。将PEC 过程与适配体传感器结合形成的PEC 适配体传感器已广泛应用于STR 快速检测。

3.1 基于贵金属纳米材料的电化学生物传感器

贵金属纳米材料由于具有极佳的比表面积和活性催化位点，促进待测分子与电极之间的电子转移，从而有效放大电化学传感器的分析信号[41]。Ghanbari等[47]采用AuNPs 和硫醇石墨烯量子点（Thiol Graphene Quantum Dots，GQD-SH）作为检测STR 的纳米材料，构建了电化学适配体传感器。构建过程首先将GQD-SH 固定在玻璃碳电极（GCE）的表面上，其次将AuNPs 通过Au-S 键固定在GQDs 的SH 基团上，最后将适配体共价吸附在AuNPs 表面上。当STR 存在时，STR 会与适配体结合形成复合物，通过检测电化学信号测定STR 的含量。该方法的检测范围是0.1～700 pg/mL，检出限为0.033 pg/mL。Li 等[48]用Pt-Sn 纳米颗粒装饰TiO2纳米棒表面，得到具有强电催化性能的金属复合材料（Pt-Sn@TiO2），然后根据Pt-Sn@TiO2复合材料和核酸外切酶辅助的靶标循环双信号放大策略开发了一种电化学适配体传感器，用于STR 的检测。Pt 和Sn 之间的协同作用，可以增强氧化还原电流，实现信号放大策略。RecJf核酸外切酶通过选择性切割STR-Apt 复合物，释放出的STR 可与电极上的Apt 再次结合，形成靶标循环信号放大策略。该方法的检测范围是0.05～1500 nmol/L，检出限为（0.020±0.0045）nmol/L。Roushani 等[49]将介孔氧化硅薄膜（Mesoporous Silica Films，MSFs）涂在金电极表面，用银纳米粒子（AgNPs）修饰MSFs，构建电化学适配体传感器检测STR。在STR 存在下，STR 会结合在适配体上并阻止[Fe（CN）6]3-/4-氧化还原探针在中孔膜的纳米通道扩散，从而降低电化学信号。在最优条件下该传感器的检测范围是1 fg/mL～6.2 ng/mL，检出限为0.33 fg/mL。

以金（Au）、铂（Pt）、银（Ag）为代表的贵金属纳米材料与其他材料结合产生协同作用，可以促进传感器电子转移，实现STR 灵敏检测，具有极好的生物传感前景。

3.2 基于碳基纳米材料的电化学生物传感器

碳基纳米材料中的有序介孔碳（Ordered Mesoporous Carbon，OMC）具有高导电性、高稳定性、较大的比表面积等优点，为构建电化学传感器提供理想的纳米平台[50]。Li 等[51]基于碳纳米纤维（Carbon nanofibers，CNFs）和有序介孔碳-金纳米粒子（OMCAuNPs）构建的电化学适配体传感器，用于检测卡那霉素（Kanamycin，KAN）和STR。在OMC 中引入AuNPs 可以提升电子转移性能、改善纳米材料的生物相容性。在没有KAN 和STR 的情况下，适配体与其互补链结合。加入KAN 和STR 后，适配体分别与各自的靶标（KAN、STR）结合，导致互补链被释放出来，通过电流峰的变化测定KAN、STR 含量。在最佳条件下，该传感器对KAN 和STR 检出限分别为87.3 和45.0 pmol/L，检测范围均为0.1～1000 nmol/L。石墨化的多壁碳纳米管（MWCNTGr）具有较高的电荷转移性能，同时还具有网络结构，可以固定更多的适配体[52]。Li 等[53]基于MWCNTGr和CNFs-AuNPs纳米复合材料，构建电化学适配体传感器同时检测KAN 和STR。以金属离子（Cd2+和Pb2+）作为信号示踪剂标记KAP（KAN适配体）和STP（STR 适配体）。当KAN 和STR 存在时，KAP 和STP 从它们的互补链中释放出来，Cd2+和Pb2+会产生不同的微分脉冲伏安（Differential Pulse Voltammetry,DPV）峰，在最佳条件下，该方法对KAN 和STR 的检出限分别是74.50 pmol/L 和36.45 pmol/L，检测范围均是0.1～100 nmol/L。

在电极表面化学修饰不同的材料，构建的电化学传感器可以实现不同待测物质的同时检测，用碳基纳米材料修饰的电极既拥有碳纳米材料的优良性质，同时又能提高电极本身的电化学信号，极大地提高了传感器的准确性和灵敏度。

3.3 基于磁性纳米材料的电化学生物传感器

磁性纳米颗粒（例如Fe3O4）电化学传感器中应用广泛[54]。Yin 等[55]以多孔碳纳米棒（Porous Carbon Nanorods，PCNR）和石墨烯-Fe3O4-AuNPs 纳米复合材料作为基质，构建电化学适配体传感器用于STR的灵敏检测。在石墨烯（Graphene，GR）和Fe3O4纳米粒子中引入AuNPs 有利于提升纳米材料与适配体的结合。当适配体与STR 结合后，会使电流发生变化，在最佳条件下，该方法的检测范围是0.05～200 ng/mL，检出限是0.028 ng/mL。Yin 等[56]将金纳米粒子功能化的磁性多壁碳纳米管（Au@MWCNTs-Fe3O4）复合材料和纳米孔PtTi（NP-PtTi）合金依次滴到玻璃碳电极（GCE）表面上来制备适配体传感器。Au@MWCNTs-Fe3O4复合材料作为生物分子固定基质，有效连接适配体；NP-PtTi 合金明显增强电化学信号，提高检测灵敏度。在最佳条件下，该传感器检测范围是0.05～100 ng/mL，检出限是7.8 pg/mL。

Fe3O4作为一种对环境友好的磁性纳米颗粒，由于可以在Fe2+和Fe3+之间发生电子转移而表现出良好的导电性能，通常与碳基纳米材料和金属纳米材料结合使用，在构建电化学适配体传感器中具有广阔的应用前景。

3.4 基于光敏材料的PEC 适配体传感器

PEC 生物传感器将光电转换技术与生物传感技术相结合，既延续了电化学生物传感器的优点，如稳定性好、灵敏度高等，同时又具有光学传感器的优势和潜力，如操作便捷，响应速度快等。目前PEC 生物传感器中常用的光敏材料有金属氧化物（TiO2[57−58]、WO3[59]、BiVO4[60]）、过渡金属化合物（CdTe[61]、CdS[62]）等。Luo 等[63]将TiO2/BiOI/BiOBr 作为可见光光敏材料，适配体作为生物识别元件，开发了一种新型的链霉素PEC 适配体传感器。适量的TiO2与BiOI/BiOBr 组合可增强光电流响应，当STR 与适配体特异性结合后会使光电流响应发生变化。在最佳条件下，该方法检测范围是0.05～150 nmol/L，检出限低至0.04 nmol/L。Okoth 等[60]将钼（Mo）掺杂BiVO4的复合物（Mo-BiVO4）和石墨烯纳米复合材料作为光敏材料构建可见光驱动的链霉素PEC 适配体传感器，当不存在STR 时，由于适配体具有位阻，PEC 适配体传感器显示出较弱的光响应。当存在STR 时，STR 与适配体特异性结合，由于光生空穴对STR 的氧化作用使传感器的光电流响应增强。在最优条件下，该PEC 适配体传感器的检测线性范围是0.1～100 nmol/L，检出限为0.0481 nmol/L。Xu 等[64]将CdTe量子点（Quantum Dots，QDs）和单壁碳纳米角（SWCNHs）合成一种新型纳米复合材料（CdTe-SWCNHs）并将其作为光敏材料，制备了链霉素PEC适配体传感器。其中SWCNHs 可以抑制电子-空穴对的重组，在加快电子转移的同时提高光电流强度[64−65]。当适配体与CdTe-SWCNHs 结合后，PEC信号明显受到抑制。当STR 与适配体结合后会使适配体从修饰的电极表面脱落，PEC 信号恢复。在最佳条件下，检测线性范围为0.1～50 nmol/L，检出限为0.033 nmol/L。Shen 等[66]提出了一种基于光电化学“信号接通”和电化学“信号断开”双重检测模型。CdTe QDs 和亚甲基蓝（Methylene Blue,MB）标记的适配体（MB-Apt）分别用于生成PEC 信号和电化学（Electrochemistry,EC）信号。目标物STR 会诱导MB-Apt 的构象发生变化，将MB 推离电极，EC信号降低；于此同时空间位阻减少有助于CdTe QDs 还原PEC 信号，使PEC 信号升高。在最佳条件下该方法的检测线性范围是0.03～100 μmol/L，检出限为10 nmol/L。

p-n 异质结构和Z-scheme 异质结构是由两种半导体组成的高效光催化剂[67]，目前已广泛应用于PEC 传感器中。Xu 等[68]基于LaFeO3@g-C3N4p-n异质结构，成功开发了一种PEC 生物传感器用于STR 的灵敏检测。其中LaFeO3@g-C3N4p-n 异质结构具有核-壳结构，可以明显提高可见光响应和电荷分离效率。当适配体固定在LaFeO3@g-C3N4上后，光电流强度降低。当适配体与STR 结合后，光电流信号进一步降低。在最优条件下的检测范围是0.01～10000 nmol/L，检出限为0.0033 nmol/L。Liu等[59]用CdTe QDs 与WO3纳米片构建新型的Zscheme 异质结构，用于STR 的快速检测。Z-scheme异质结构通过模拟绿色植物的光合作用，可实现接近100%的电荷分离量子效率[69−70]，应用在PEC 传感器中可以提高光电流响应。当适配体与STR 结合后，由于空间位阻增大导致光电流降低。该方法的检测线性范围是1.5～728.5 μg/kg，检出限为0.5 μg/kg。

以上四种电化学适配体传感器虽然具有样品处理简单、易于小型化、具有良好的重现性、选择性和检测灵敏度等优点，但目前还只是建立在实验室阶段。

4 结论与展望

近年来随着科学技术的进步，生物传感器技术也得到飞速发展。与其他识别元件相比适配体具有更高的稳定性、更易合成与修饰、成本更低等优点而广泛应用于生物传感器中。本文综述了近五年基于适配体的光学、电化学生物传感器传感器在STR 快速检测中的应用，其中光学传感器（以化学发光、荧光、比色为例）可以实现可视化即时检测，但是在安全性（某些荧光团有毒）、选择性（易受检测体系中其他物质干扰）等方面有待改善；电化学传感器具有易于小型化、样品无需复杂处理、灵敏度较高等优点，但要实现工业化应用仍有较长的路要走。

综上所述，不同的生物传感器各有利弊，需要根据食品样品特点和应用需求选择合适的检测方法。为实现STR 生物传感器朝着简单、快速、成本低、灵敏度高、现场即时检测的方向发展，在今后的研究中：随着纳米技术的不断发展，新型功能性纳米材料层出不穷，该材料具有较强的吸附能力、良好的生物相容性，可以加快电子传递、放大电流信号等优点。因此,扩大功能性纳米材料的选用范围，有望为生物传感器的研究和应用提供新途径；将生物传感器与其它技术（光学、电化学等）的联用建立一个较为完整的多组分快速检测平台，满足食品中多种抗生素的快速检测。该平台对提高检测效率、降低检测成本有重要的实际意义。