超声辅助硫酸水解法制备银杏果壳纳米纤维素及其特性表征

薛 刚，何 易，李小白，章 智，张有做，许光治,*

（1.浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江省农产品品质改良技术研究重点实验室，浙江杭州 311300；2.山西省大同市综合检验检测中心，山西大同 037000）

纳米纤维素是纤维素通过酸水解或机械处理等去除无规区而获得的直径1～100 nm 的超微细纤维素[1]。NCC 具有比表面积大、生物相容性好、高结晶度、高杨氏模量[2−4]等特性，在医药[5−6]、复合材料[7]、食品工业[8]等邻域均有广阔的潜在应用前景。农业废物中含有大量的纤维素，来源广泛且经济是制备NCC 的重要原料。但纤维素来源和制备工艺的差异对NCC 产率、形态尺寸、结晶度等有一定影响，可改变其作为增强材料的性能和应用范围[9]。因此，有关不同原料和制备工艺对NCC 结构影响的研究引起越来越多的关注[10−14]。

我国是银杏的发源地，现有广东南雄、江苏泰兴、江苏邳州、山东郯城、湖北安陆、浙江长兴六大银杏产业基地。2015年，我国银杏果产量1.8 亿吨，约占世界总量的70%[15]。果壳作为农业废弃物通常直接燃烧或掩埋在土壤中，不仅破坏环境而且浪费资源[16]。银杏果壳约含44.34%纤维素，是良好的纤维素源，可用于NCC 的制备[15]。近些年来，为了进一步提高NCC 的产率，有关更加绿色高效制备前处理的研究越来越多，包括有机酸水解前处理、低共熔溶剂前处理、离子液体前处理和溶剂辅助前处理等，更多的是将几种方法结合。最近，Yang 等[15,17]以银杏果壳为原料，通过酸水解结合高压均质法处理制得不同长度的NCC，并比较不同长度的NCC 对Pickering乳液稳定性的影响，结果表明，小尺寸和高疏水性的NCC 具有更低的界面张力，NCC 可充当Pickering稳定剂并形成界面膜。而以银杏果壳为原料制备NCC 的条件优化及表征鲜有报道。

本实验以银杏果壳为原料，采用超声辅助硫酸水解法制备银杏果壳NCC，以单因素为基础进行正交试验来优化其制备条件，并比较超声辅助和常规硫酸水解处理对银杏果壳NCC 形态、粒径、晶体结构、红外光谱特性、热稳定性等特性的影响，以期高效地获得银杏果壳NCC，为银杏果壳废弃物的再利用和NCC 的制备研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

银杏果 2019年9月采自浙江农林大学东湖校区（剥壳，脱去内皮，洗净，果壳60 ℃烘干，粉碎后过80 目筛，正己烷脱脂，4 ℃冰箱保存备用）；亚氯酸钠、硫酸、氢氧化钠、冰醋酸、乙二胺四乙酸二钠、硼酸钠、十二烷基硫酸钠、乙二醇乙醚、无水磷酸氢二钠、十六烷三甲基溴化铵、十氢化萘、无水亚硫酸钠、丙酮等其他试剂 分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

KQ-500DE 数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；TGL-20B-C 高速离心机 上海安亭科学仪器厂；ZetaPALS 电位及粒径分析仪 美国Brookhaven 公司；Quanta 650 扫描电子显微镜 美国FEI公司；JEM-1400EX 透射电子显微镜 日本JEOL 公司；XRD 6000 X-射线衍射、IR Prestige-21 傅立叶变换红外光谱仪 日本岛津有限公司；STA 409C 综合热分析仪 德国Netzsch 公司；Freezone 冷冻速干机美国Labconco 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 银杏果壳纤维素提取 银杏果壳木质素和半纤维素的去除按照参考文献[10]进行。木质素去除：取银杏果壳粉，按料液比1:10 加1.5%（w/v）的亚氯酸钠溶液（pH=3～4），70 ℃水浴中持续搅拌2 h，抽滤，水洗滤渣至中性，重复漂白过程5～6 次，直到获得白色产物。半纤维素去除：去除木质素的银杏壳用1 mol/L NaOH 溶液处理2 h（65 ℃），抽滤去除溶解的半纤维素，水洗滤渣至中性，得到化学纯化的银杏果壳纤维素（chemically purified cellulose from ginkgo nut shell,CPC-GNS），60 ℃干燥，粉碎备用。

1.2.2 主要化学成分测定 银杏果壳和银杏果壳纤维素中纤维素、木质素和半纤维素含量的采用范氏（Van Soest）法[18]测定。

1.2.3 银杏果壳纳米纤维素的制备 称取上述银杏果壳纤维素，按1:20 的料液比分散于指定浓度（按质量分数计）的硫酸水溶液中，室温润胀10 min。将混合液置于恒定功率（120 W）的超声波清洗器中，不断搅拌，恒定温度下反应一定时间后，加入约20 倍的4 ℃预冷去离子水终止反应。对反应产物进行高速离心（10000 r/min，10 min），弃取上清液，沉淀物用去离子水洗涤，重复3～4 次离心（溶液呈弱酸性）至上层液体为乳白色的纳米纤维素悬浮液，将此悬浮液装入透析袋中，用去离子水透析至pH 呈中性。透析好的NCC 悬浮液经真空冷冻干燥得到银杏果壳纳米纤维素粉末。

1.2.4 NCC-GNS 得率的测定 取20 mL 透析至中性的NCC-GNS 悬浮液于称量瓶中，105 ℃烘干至恒重，取出至干燥器内冷却30 min，称重，按下面的公式计算得率。

式中：Y—纳米纤维素得率，%；m1—干燥后称量瓶和样品的总质量，g；m2—称量瓶的质量，g；m3—纤维素原料的质量，g；V1—纳米纤维素悬浮液的总体积，mL；V2—量取的纳米纤维素悬浮液的体积，mL。

1.2.5 单因素实验 取一定量的银杏果壳纤维素，按方法1.2.3 制备NCC。以NCC 得率为指标，选取硫酸质量分数（44%、46%、48%、50%、52%）、反应温度（50、55、60、65、70 ℃）、反应时间（15、20、25、30、35 min）作为单因素条件进行实验分析，选取某一因素进行实验时，其他因素均选取固定水平（硫酸质量分数48%、反应温度60 ℃、反应时间25 min）对应的参数。

1.2.6 正交试验 为了优化实验参数，根据单因素实验的结果，以NCC 得率为考核目标，采用正交试验来研究硫酸质量分数、反应温度和反应时间对NCC 得率的影响，以确定最佳的制备条件，正交试验设计见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.7 NCC 形貌表征

1.2.7.1 SEM 分析 用扫描电子显微镜进行形貌观察。取干燥备用NCC，通过导电胶沾在干净的样品台上，并进行喷金处理，设置电压为1 kV。

1.2.7.2 TEM 分析 用透射电子显微镜观察NCC的形态和粒径分布情况。将镀碳支持膜铜网放置封口膜上，取一滴NCC 悬浮液（1wt%）到支持膜表面，停留10 min，去除多余溶液。再将干燥后的支持膜放置封口膜上，加1 滴醋酸双氧铀染液，染色约90 s，吸去多余染液，干燥3 h 后进行观察。

1.2.7.3 粒径分析 从透射电镜照片中选取100 个单独NCC，利用Gatan Digital Micrograph image J软件进行标记，用图片尺寸测量NCC 的长度和直径，通过Origin 软件来完成数据统计分析制图。

1.2.7.4 Zeta 电位和DLS 测定 用ZetaPALS 测定NCC 悬浮液的Zeta 电位和颗粒尺寸，测试条件为25 ℃，测试3 次，取平均值。

1.2.7.5 XRD 测定 用X-射线衍射仪进行测定，Cu靶，电压40 kV，电流30 mA，扫描范围为5°～40°，连续扫描，扫描速度2°/min，间距0.02°。用分峰法将无定型区散射与各晶面的衍射峰分开，根据各峰的面积计算结晶度Xc[19]。

1.2.7.6 FT-IR 测定 用傅立叶变换红外光谱仪（KBr 压片法）记录样品的红外光谱，扫描范围400～4000 cm−1。

1.2.7.7 TGA 测定 用综合热分析仪分析样品的热力特性，温度范围为30～600℃，升温速率为10 ℃/min。

1.3 数据处理

实验采用 SPSS 25.0、Jade 5、Origin 2017 等软件进行数据处理与统计分析。

2 结果与分析

2.1 银杏果壳及银杏果壳纤维素主要化学成分分析

本实验使用的银杏果壳主要化学成分为：木质素（52.12±0.89）wt%、纤维素（36.26±1.03）wt%、半纤维素（4.52±0.91）wt%（见表2），主要化学成分与Yang 等[15]报道的数据基本一致。通过亚氯酸钠和NaOH 处理去除木质素和半纤维素，得到银杏果壳纤维素，其纤维素含量提高至（83.22±1.18）wt%，木质素和半纤维素的含量分别降至（5.05±0.81）wt%和（0.53±0.17）wt%，表明化学纯化得到的银杏果壳纤维素可用于NCC 的制备。

表2 银杏果壳和银杏果壳纤维素化学成分Table 2 Chemical composition of GNS and CPC-GNS

2.2 单因素和正交实验分析

2.2.1 硫酸质量分数对NCC-GNS 得率的影响 由图1可知，随着硫酸质量分数的不断提高，NCCGNS 的得率呈先增大后减小的趋势，当硫酸的质量分数为48%时NCC-GNS 的得率最高，为37.01%。硫酸浓度是NCC-GNS 制备的关键因素，不同来源的纤维素结构存在差异，制备NCC-GNS 所需硫酸的浓度也不尽相同。硫酸浓度较低时体系中的氢离子浓度较小水解程度较低，难将纤维水解到纳米级别，NCC-GNS 得率低；随着硫酸浓度的升高，更多纤维素分子之间的糖苷键发生断裂，产生更多的纳米级纤维素，NCC-GNS 得率增加。但过高的硫酸浓度又会导致纤维素的进一步水解，降解为葡萄糖，使得NCC-GNS 得率降低[13]。

图1 硫酸质量分数对NCC-GNS 得率的影响Fig.1 Effect of sulfuric acid mass fraction on NCC-GNS yield

2.2.2 反应温度对NCC-GNS 得率的影响 由图2可知，随着反应温度增加，NCC-GNS 的得率先增大后减小，当反应温度为60 ℃时NCC-GNS 的得率最高，为37.06%。这是因为反应温度会影响硫酸水解纤维素的效率，温度较低时酸水解反应不充分，NCCGNS 得率较低，随着反应温度的升高，促进了更多纤维素分子链上糖苷键的断裂，纤维素被水解细化到纳米级别。但过高的反应温度也降低NCC-GNS 得率，甚至还会导致纤维素的炭化[20]。

图2 反应温度对NCC-GNS 得率的影响Fig.2 Effect of reaction temperature on NCC-GNS yield

2.2.3 反应时间对NCC-GNS 得率的影响 由图3可知，随着反应时间的增加，NCC-GNS 的得率先增大后减小，当反应时间为25 min 时NCC-GNS 的得率最高，为36.58%。这是因为酸解时间较短时纤维素与硫酸接触不充分，反应不完全，随着反应时间的增加，水解反应进行程度不断增大。但是过长的反应时间，纤维素在硫酸溶液中发生均相水解反应，纤维素进一步降解为葡萄糖，使得NCC-GNS 得率降低。

图3 反应时间对NCC-GNS 得率的影响Fig.3 Effect of reaction time on NCC-GNS yield

2.2.4 正交试验结果 根据单因素实验的结果，以NCC-GNS 得率为指标，采用正交试验来研究硫酸质量分数、反应温度和反应时间对NCC-GNS 得率的影响，以确定最佳的制备条件。正交试验结果及直观分析见表3。

表3 正交试验结果及直观分析Table 3 Orthogonal test results and visual analysis

由表3极差分析结果可以得出，A、B、C 三个因素影响得率的主次顺序为硫酸质量分数>反应温度>反应时间，最佳条件组合为 A2B2C2，即硫酸质量分数48%、反应温度60 ℃、反应时间25 min。进一步检验3 个因素的显著性程度，对实验结果进行方差分析，分析结果见表4。

表4 方差分析表Table 4 Variance analysis table

由表4可知因素A、B、C 对实验结果都有显著的影响。实验指标是NCC-GNS 的得率，在不考虑交互作用的情况下，最优方案应取各因素最大K 值所对应的水平，为A2B2C2，即硫酸质量分数48%、反应温度60 ℃、反应时间25 min。与单因素实验结果相符。在最优条件下进行验证实验，得到NCCGNS 的得率为36.89%±1.2%。

本实验采用超声辅助硫酸水解法制备NCCGNS，主要利用超声波的空化作用提高反应效率，较高于常规硫酸水解（未加超声辅助，硫酸质量分数48%、反应温度为60 ℃、反应时间为25 min，制备NCC-GNS 的得率30.16%±0.91%）。

2.3 NCC-GNS 表征

为分析NCC-GNS 的结构特征，在最优制备条件下，对超声辅助硫酸水解法制备的NCC-GNS和常规硫酸水解法制备的NCC就形态、粒径、Zeta电位、结晶度、红外光谱及热力学特性进行表征。

2.3.1 形貌观察 NCC-GNS 和NCC 的扫描电镜如图4所示，NCC-GNS 呈棒状结构，纳米棒紧密的缠结在一起，形成了类似“薄膜”一样的结构。

图4 NCC-GNS 和NCC 的扫描电镜Fig.4 SEM of NCC-GNS and NCC

NCC-GNS 和NCC 的透射电镜结果如图5所示，与扫描电镜结果一致，NCC-GNS 呈棒状结构，棒状细长，纳米棒之间有粘连和堆叠的现象。但NCCGNS 较NCC 分布均匀，这可能是因为超声辅助处理促进了纳米棒的分布。但NCC 粒径很小，比表面积巨大，使得纳米棒之间受范德华力的影响较为明显，导致团聚和堆叠现象的发生[21]。

图5 NCC-GNS 和NCC 的透射电镜Fig.5 TEM of NCC-GNS and NCC

2.3.2 粒径分析 根据透射电镜的结果，进一步用软件Gatan Digital Micrograph image J 分析NCC-GNS的长度和直径分布。由图6可知，NCC-GNS-Y 长度集中在80～180 nm，直径集中在3.5～5.5 nm，而NCCGNS-N 长度和直径范围更宽，长度在40～220 nm，直径在3.5～7.5 nm。说明超声辅助处理制备的NCCGNS 尺寸更加均匀，与透射电镜观察的结果相符。NCC-GNS-Y 长径比为27±3，大于以开心果壳和菠萝叶等废弃物为来源制备的NCC[11,22]。高长径比会增加界面面积，从而提高复合材料的机械性能[12]。NCC-GNS-Y 直径小、长径比较高，在复合材料中有较好的应用前景。

图6 NCC-GNS-Y 和NCC-GNS-N 长度和直径分布图Fig.6 Distribution of length and diameter of NCC-GNS and NCC

2.3.3 Zeta 电位和DLS 分析 超声辅助和常规硫酸水解制备NCC-GNS 悬浮液的Zeta 电位和DLS 分析如表5所示。NCC-GNS 和NCC 悬浮液Zeta 电位绝对值均大于30.00 mV，表明体系比较稳定；NCC-GNS 经DLS 测得长度尺寸略小于NCC；经DLS 测得两种方法制备的NCC-GNS 长度尺寸略小于TEM 的观察结果，其悬浮液的Zeta 电位和粒径大小无明显差异。

表5 Zeta 电位和DLSTable 5 Zeta potential and DLS

2.3.4 X-射线衍射分析 银杏果壳、银杏果壳纤维素、NCC-GNS 和NCC 的X-射线衍射如图7所示，样品均都在2θ=14.7°、16.4°、22.4°处出现了较强的衍射峰，分别对应的是1-10、110 和200 晶面，与天然纤维素Ⅰβ 的特征衍射峰一致[23]，表明酸水解和超声处理均未改变主晶体结构。但NCC-GNS 和NCC 出现了两个小峰（图7，虚线圆圈标记为1 和2），可能是由于少量的纤维素II 存在造成的。样品结晶度从原料GNS 的52%分别提高至NCC 的75%和NCC-GNS 的88%。与陆红佳等[24]超声波辅助酸法制备纳米薯渣纤维素的结果相似，超声处理提高了NCC 的结晶度。说明超声处理通过空化作用促进了NCC 的水解分离，对NCC-GNS 的结晶度产生积极的影响。

图7 银杏果壳、银杏果壳纤维素和NCC-GNS XRD 图Fig.7 X-ray diffraction of ginkgo biloba shell,ginkgo biloba shell cellulose and NCC-GNS

2.3.5 红外光谱分析 银杏果壳、银杏果壳纤维素、NCC和NCC-GNS 的FT-IR 光谱如图8所示。不同样品的特征峰没有发生明显变化，说明超声辅助硫酸水解制备NCC 过程中未破坏和改变纤维素分子的主要化学结构。纯化和提取纤维素的过程，1730、1510 和1270 cm−1处的光谱峰逐渐消失，表明大部分木质素和其他多糖已被去除[10]，这些谱峰与酯基（C=O）的特征拉伸频率和木质素、半纤维素以及其他组分中的芳环拉伸振动有关[2]。

图8 银杏果壳、银杏果壳纤维素和NCC-GNS 红外光谱图Fig.8 FT-IR spectrum of ginkgo biloba shell,ginkgo biloba shell cellulose and NCC-GNS

由图7可知，两种方法制备的NCC-GNS 与NCC均存在纤维素Ⅰ的特征吸收谱带：1435、1061 和895 cm−1处的吸收峰分别对应-CH2-（C6）-弯曲、吡喃糖环C-O 拉伸和β-糖苷键的弯曲振动吸收峰。在1636、3420 和2900 cm-1处的吸收峰分别对应吸附水中H-O-H 的弯曲振动、纤维素分子中羟基的OH 的伸缩振动和亚甲基的C-H 对称伸缩振动吸收峰[25]。NCC-GNS 和NCC 在1200 cm−1出现的小峰是硫酸基团S=O 振动的结果，酸水解后NCC-GNS表面引入的带负电荷的硫酸基团[26]。

2.3.6 热重分析 银杏果壳、银杏果壳纤维素、NCC 和NCC-GNS 热重分析如表6和图9所示。根据以前的研究[27]，第一阶段出现的热失重现象，温度低于100℃，主要与吸收水的蒸发有关；第二阶段，温度大于170℃时开始纤维素热分解过程，包括解聚、脱水和糖苷单元的分解；第三阶段热分解过程温度大于270℃，主要是纤维素分解的残余烧焦物。由DTG曲线可以看出，NCC-GNS、NCC 和银杏果壳纤维素最大失重速率时的温度分别为254、309、331 ℃，NCC-GNS 最大失重速率时的温度明显小于NCC 和银杏果壳纤维素。原因是经硫酸水解制备的NCCGNS 表面接枝了带负电荷的磺酸基，超声辅助使得NCC-GNS 的表面热暴露增大从而接入了更多的磺酸基团[28]，从而降低了NCC-GNS 的热解温度。由于磺酸基团的阻燃行为和NCC-GNS 的高结晶度[29]，在600 ℃时，NCC-GNS 的残余率为24.38%，高于银杏果壳纤维素。

表6 综合热分析结果Table 6 Result of comprehensive thermal analysis

图9 银杏果壳、银杏果壳纤维素和NCC-GNS TG、DTG 图Fig.9 TG and DTG curves of ginkgo biloba shell,ginkgo biloba shell cellulose and NCC-GNS

两种方法制备的银杏果壳纳米纤维素，它们的TG 和DTG曲线变化趋势极为相似，制备的银杏果壳纳米纤维素具有良好的热稳定性，在耐热性复合材料中应用表现出一定潜能[30]。

3 结论

本实验探究了超声辅助硫酸水解法对制备NCC-GNS 的影响，并通过单因素实验和正交试验获得最优制备条件。超声辅助和常规硫酸水解法制备的银杏果壳纳米纤维素均为长棒型，尺寸无明显差异，其中超声辅助制备的银杏果壳纳米纤维素长度和直径范围相对集中。两种方法制备的银杏果壳纳米纤维素均具有较低的Zeta 电位。超声辅助硫酸水解制备的银杏果壳纳米纤维素结晶度为88%，高于常规硫酸水解的75%，仍属纤维素Ⅰβ型。此制备过程中未发生化学结构的破坏和改变，纤维素分子的化学结构保持不变。超声辅助硫酸水解制备的NCCGNS 在600 ℃时仍有较高的残余率（24.38%），有良好的热稳定性。采用超声辅助硫酸水解法制备出的高得率、高长径比、高结晶度、良好热稳定性的纳米纤维素有望在食品包装、复合材料等领域中得到进一步应用。