玉米醇溶蛋白/聚环氧乙烷同轴静电纺丝负载姜黄素及其释放特性

金晓春，安 琪，王心雅，黄洪亮，甄 诺，张 浩,*，李云琦，刘景圣,*

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，小麦和玉米深加工国家工程实验室，吉林长春 130118；2.中国科学院长春应用化学研究所，中国科学院高性能合成橡胶及其复合材料重点实验室，吉林长春 130022）

随着消费者对食品品质和食品保鲜需求的提高，以及环保意识的增强，用天然生物材料制成的具有可食性及抗菌性的包装膜因更好地满足人们的需要而被广泛研究。姜黄素（Curcumin）是世界上目前销量最大的天然食用色素之一，具有抗炎、抗菌、抗氧化、调脂、抗病毒、抗感染、抗肿瘤、抗凝、抗肝纤维化、抗动脉粥样硬化等广泛的药理活性，且毒性低、不良反应小[1−2]，是世界卫生组织和美国食品药品管理局以及多国准许使用的食品添加剂[3]。但姜黄素在具体的应用上如药物和营养补充剂等却十分有限，这主要是因为姜黄素很难溶于水，口服姜黄素的生物利用度非常低[4]。通过将姜黄素添加到纳米纤维膜中，利用纳米纤维膜的可控释放过程提高了纤维膜的抗菌性[5]，延长可食用包装产品的保质期，在食品贮藏保鲜等方面，提高保鲜效率，达到保鲜目的。

玉米醇溶蛋白是加工产生玉米淀粉的副产物玉米黄粉的主要成分，玉米醇溶蛋白（Zein）不溶于水而溶于65%～90%的乙醇水溶液[6]，借助小角X 光散射（small angle X-ray scattering,SAXS）可以分析玉米醇溶蛋白在溶液中的结构特征、分散状态[7−8]。Zein是一种天然的高分子蛋白，具有生物可降解性和生物兼容性，一方面可以作为保鲜材料，另一方面可以作为薄膜涂层在食品的保鲜上发挥作用。玉米醇溶蛋白纳米纤维呈带状，可以通过添加一些高分子例如聚环氧乙烷（PEO）等，增加其缠结度，使得静电纺丝纤维更加圆滑[9]。Zein 具有良好的成膜性、抗氧化性、溶解性、缓释性等，可用于制造环保型贮藏包装材料、保鲜膜、可控释放的原料等方面，在食品、医药、纺织、造纸等行业得到了广泛的应用[10]。姜黄素与Zein 的独特性能使它们可以很好地结合在一起使用[11]，既能达到易降解可食用的作用，也可增加其抗菌时间。

现今，包埋技术经常用于天然抗菌剂的包埋处理，通过缓慢释放以提高抗菌剂的长效抗菌性能。在包埋过程中，壁材的选择非常重要，食品加工常用的包埋壁材主要有多糖、蛋白质、表面活性剂和脂质等等。另外，最常见的包埋技术主要包括：乳化均质法、喷雾干燥法、脂质体包埋法和凝聚法等[12]。然而，这些包埋法在处理过程中涉及的压力、机械力和高温等等会导致天然抗菌剂降解或失活。因此，目前的包埋方法仍有很多不足之处，需要研究出一种新型合适的、天然的包埋方法。

静电纺丝技术是一种能够连续生产纳米纤维的技术，由于其操作简便，绿色环保，在近些年来广受关注[13]。通过静电纺丝技术制备的纳米纤维具有高孔隙率、高比表面积、高气体渗透性以及纤维孔径小等诸多优点[14]。在静电纺丝过程中，无需高温或者加压处理，十分适合用于包埋对环境敏感的天然抗菌剂。首先对装在注射器中的聚合物溶液或熔体施加数千至数万伏的高压，聚合物溶液或熔体在针头会形成一个泰勒锥，当施加的电场力足够大时，能够克服表面张力和溶液黏度，聚合物溶液或熔体就会喷射而出，在喷射过程中溶剂逐渐挥发，聚合物固化最终在接收装置上形成纤维[15]。同轴静电纺丝不同于单轴静电纺丝，利用两个同轴喷头同时将两种聚合物溶液在电场中喷射出，该法能够产生连续双层的核壳结构纳米纤维，鞘溶液将芯溶液包埋在内部形成核/壳结构的纳米纤维[16−17]。本实验通过同轴静电纺丝技术将Zein 和PEO 电纺制成核/壳纳米纤维[18]，将姜黄素包裹在壳中，使得姜黄素能够缓慢释放。通过电化学工作站的循环伏安法测得包裹在纳米纤维中的姜黄素的缓释效果，再选用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌这两种菌作为原料，进行抗菌试验和动力学释放试验，研究包裹在玉米醇溶蛋白膜中的姜黄素的释放及抗菌效应，以期为其应用提供参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米醇溶蛋白（Zein），纯度为98% 北京百灵威公司；聚环氧乙烷（PEO） Alfa Aesar Ltd 公司；姜黄素（Curcumin），纯度为98% 北京百灵威公司；无水乙醇 分析纯，北京化工厂。

DW-P303-1ACFO 数显直流高压电源 东文高压电源有限公司；SPLab04 注射推进泵 保定申辰泵业有限公司；Rc-5000 滚筒式收丝器 深圳市通力微纳科技有限公司；JEM1011 透射电子显微镜 日本电子公司；Pro 扫描电子显微镜 PHENOM 公司；Nicolet 170-SX 型傅立叶红外吸收光谱仪 Thermo Nicolet 公司；D8 ADVANCE 型广角X 射线衍射仪

德国BRUKER 公司；Avalight-DHS-BAL 光纤光谱仪 AVANTES 公司；AUT302N 电化学工作站瑞士万通公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液配制 室温条件下，80%（v/v）乙醇水溶液作为溶剂，制备聚环氧乙烷（13wt%）和玉米醇溶蛋白（30wt%）溶液，玉米醇溶蛋白（30%）溶液在磁力搅拌器下搅拌2 h 即可，避免老化，使用磁力搅拌器搅拌24～36 h 以确保聚环氧乙烷完全溶解。将配制好的Zein 溶液和PEO 溶液均以1:1 的质量比溶解在80%乙醇水溶液中，分别制备Zein、PEO 和混合溶液三种溶液[18]。姜黄素与Zein 溶液和PEO 溶液混合配制时，配制浓度为20 mg/mL。

1.2.2 纤维膜制备 将静电纺丝装置水平放置，并选择两个20 mL 注射器放置在两个推进装置上并用聚四氟乙烯管连接到同轴针上。在静电纺丝之前，小心地排出针中的空气和溶液中的气泡。内针和外针编号为17（内径：0.51 mm；外径：0.81 mm）和21（内径：1.04 mm；外径：1.50 mm）。电压为20 kV，流速为0.4～2 mL/h，针尖和收集器之间的距离固定为14 cm，静电纺丝的环境温度（23 ℃，50%相对湿度），高压正电荷接头连接到接地引脚的末端。玉米醇溶蛋白溶液配制30wt%的溶液，聚环氧乙烷配制13wt%的溶液，姜黄素参照混合溶液配制浓度为20 mg/mL。用Zein 作壳与PEO 和姜黄素混合溶液为核得到的纤维记为Z-p+cur，Zein 和PEO 混合溶液作壳与PEO和姜黄素混合溶液为核得到的纤维记作Z/p-p+cur，Zein 和PEO 混合溶液作壳与Zein 和姜黄素混合溶液为核得到的纤维记作Z/p-z+cur。

1.2.3 膜的微观形貌 使用透射电子显微镜（TEM）通过加速100～200 kV 之间的电压来观察纤维的微观形貌，同时选用扫描电子显微镜（SEM）在加速电压在10～20 kV 之间观察其纤维的表面形貌。

1.2.4 傅里叶红外吸收光谱 使用Nicolet 170-SX 装备有SPECAC衰减全反射（ATR）附件的Cary 670傅立叶变换红外光谱仪进行表征。以2 cm−1的分辨率记录纳米纤维膜的傅里叶变换红外光谱（FTIR）对不同核/壳的纤维进行32 次扫描，波数范围在500～4000 cm−1之间。

1.2.5 X-RD 衍射分析 不同核壳的玉米醇溶蛋白/聚环氧乙烷纤维膜通过X 射线衍射（X-RD）CuKα辐射源在40 kV 的电压和35 mA 的电流的条件下，扫描范围在10o～40o。

1.2.6 UV 分析 使用光纤光谱仪测得姜黄素的吸光值，在波长430 nm 处有紫外吸收峰，根据得到的吸光值与浓度的关系确定标准曲线，进而测定姜黄素在纤维中的包封率。进行测量之前要先用纯净水冲洗样品表面，确保除去表面的姜黄素，然后将样品溶解在10 mL 的80%乙醇水溶液，测量溶液中的姜黄素含量，计算封装效率：

式中：实际浓度是光纤光谱仪测量计算所得，理论浓度是根据配制样品时实际负载量。

1.2.7 循环伏安分析 取0.03 g 包裹姜黄素的纤维膜放置于10 mL 的酸性电解液中，pH 范围为3～5，随着PEO 含量增加，酸性增强，室温条件下将电解池置于搅拌器上（130 r/min）不断搅拌。在不同的时间间隔内，利用伏安循环伏安法测试姜黄素的释放量，电压扫描速率0.16 V·s−1,扫描范围为0～1 V。通过姜黄素的回归方程计算出姜黄素的释放量。累积释放姜黄素百分率计算如下：

式中：Mt是在任意时间t 释放的姜黄素的量，mg；M0是纤维中的姜黄素的初始量，mg。

1.2.8 抗菌试验 在摇床平台（37 ℃，200 r/min）上对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行好氧培养，不同核壳的包裹姜黄素的玉米醇溶蛋白纤维作为基底，用光密度（OD）和时间关系绘制两种菌的生长曲线。然后分别用营养琼脂（NA）稀释后计数活细胞，检测金黄色葡萄球菌和大肠杆菌108 个菌落形成单位（CFU）。在600 nm（OD600）下，当每毫升的光密度为0.1 时，稀释到100 mL 的新鲜培养基中。把含姜黄素和对照组不含姜黄素的纤维膜等质量加入到100 mL 的培养基中，然后放在振动床上在160 r/min，37 ℃条件下进行培养，在细菌生长过程中，分别取2、4、8、12、24、36 和48 h，在OD600用酶标仪进行测试。抑菌效率：

1.3 数据处理

所有数据均测试5 次，取平均值并计算标准差。用Origin 2018 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 姜黄素的负载

图1（a～c）表示的是静电纺丝玉米醇溶蛋白、聚环氧乙烷和姜黄素混合纳米纤维的透射电镜图。在TEM 的观察中，由于核和壳材料的密度存在差异，因此通过核心传输的电子更少，观察的图像也就更暗。如图1（a～c）所示，同轴纤维膜中形成了具有液滴状的物质，姜黄素负载在同轴的纤维膜中,核心层被外层完全包封，在恒定电压为20 kV，静电纺丝距离固定14 cm 的情况下，核壳的物料速率分别为2.0 和0.4 mL/h，通过静电纺丝技术，由两个同轴毛细管组成的喷丝头可以通过内外毛细管通道同时供给两个组分；负载在核芯内的有些姜黄素没有在壳的正中心，是由于静电纺丝过程中带电射流的弯曲不稳定和搅打运动导致的部分偏心。壳中均含有玉米醇溶蛋白，推测玉米醇溶蛋白独特的疏水性可以有效地阻止介质渗透到核壳芯层，从而维持功能组分释放。

图1 TEM 表征分析Fig.1 TEM characterization analysis

图1d 和图1e 是姜黄素以及含姜黄素的纤维毡在不同纤维毡中的红外光谱图，在1640 cm−1（酰胺I）和 1520 cm−1（酰胺 II）位置分别出现强峰，这源于玉米醇溶蛋白分子中的C=O 键，C-N 键伸缩振动所致。聚环氧乙烷在2880 cm−1附近出现峰值，对应着C-H 的拉伸振动，1085 cm−1处的峰位可能是由于聚环氧乙烷的CO（C-O-C）键的非对称伸缩模式。玉米醇溶蛋白/聚环氧乙烷纳米纤维出现强烈的吸收峰，分别为C-O 拉伸和N-H 的弯曲振动模式，表明玉米醇溶蛋白的特征峰和N-H 的拉伸出现略微变化，并且相对应的波数值位移更高[19]。姜黄素的特征峰在3509、1625、1340 和1250 cm−1附近，1400 cm−1表示出C-C 弯曲振动和酚醇-OH 基团。在含姜黄素的纳米纤维中，姜黄素在3509 cm−1的峰完全消失，可能是因为在核壳结构中姜黄素的羟基与醚基相互作用。在姜黄素和玉米醇溶蛋白纳米纤维光谱中没有观察到C-O 伸缩和N-H 弯曲，也证实了玉米醇溶蛋白和姜黄素之间是氢键结合的，所以通过红外光谱也可以证明姜黄素与纳米纤维之间存在相互作用。

图1f 是负载姜黄素纤维毡的XRD 图。玉米醇溶蛋白混聚环氧乙烷包聚环氧乙烷加姜黄素（Z/pp+cur）浅蓝线，玉米醇溶蛋白混聚环氧乙烷包玉米醇溶蛋白加姜黄素（Z/p-z+cur）粉线。X-RD 图表明出了姜黄素粉末是以结晶的形式存在，在10°和30°之间的2θ 处都有显尖峰存在[20]，而玉米醇溶蛋白两个峰的强度明显不如聚环氧乙烷粉末和姜黄素粉末，说明Zein 的定形性不强，而Zein 两个峰的形成是因为玉米醇溶蛋白的螺旋填充和α-螺旋骨架[10,21]。在2θ=19.2°和2θ=23.3°是聚环氧乙烷粉末的特征峰，在含姜黄素的玉米醇溶蛋白纤维膜上表现出来该位置的峰，峰强有所减弱，一部分是加入了玉米醇溶蛋白的原因，还有是由于静电纺丝物质不能像粉末物质的那样积聚，所以显示出峰强减弱。在含姜黄素的纤维膜上2θ=17.2°中出现了一个小的姜黄素峰，表明了负载的成功性，同时也证实了姜黄素在纤维中以结晶的形式存在。

通过TEM、FT-IR 和XRD 这些测试都可以证明纳米纤维膜成功负载上姜黄素，不同核壳结构的纳米纤维膜也都成功将姜黄素包封在纤维内。

2.2 姜黄素的紫外线吸收

图2a 测量出了包埋在纤维内的不同含量姜黄素的紫外光谱曲线，在430 nm 处有明显的紫外吸收峰。由图2b 可以计算出不同核/壳纳米纤维中的姜黄素的封装效率值。结果如表1所示，数据表明90%以上的的姜黄素被包封在玉米醇溶蛋白静电纺丝纤维中（Z-p+cur：96.02%；Z/p-p+cur：95.00%；Z/pz+cur：90.15%）。通过同轴静电纺丝的手段将姜黄素加载到纤维中后，在芯壳中的姜黄素可以很好地被保护，从而达到更好的释放效果，其中已有报道应用单轴静电纺丝技术将原花青素包封在玉米醇溶蛋白纤维中[22]。还有使用玉米醇溶蛋白作为静电纺丝载体，其他功能组分也会被选用包封其中，例如基于鱼油的异丙醇基封装在玉米醇溶蛋白静电纺丝纤维中[23]。因此，玉米醇溶蛋白纳米纤维可用作功能性食品组分的有效包封剂，还可以在功能组分缓释方面起到重要作用。

表1 不同核壳纤维中姜黄素的封装效率Table 1 Encapsulation efficiency of CUR-containing core-shell fibers

图2 姜黄素在水溶液中的紫外吸光谱（a）和姜黄素浓度的标准曲线(b)Fig.2 UV absorption spectrum of curcumin in aqueous solution（a）and the standard curve of curcumin concentration（b）

2.3 循环伏安法

如图3a 所示，在50 mL 电解质溶液中，c=0.263 mmol/L（12%v/v 乙醇，0.033 mol/L 酒石酸，0.1 mol/L NaCl），用NaOH 调节至pH3.6，进行了姜黄素的循环伏安图扫描，速率范围为0.01～0.36 V/s，可以观察到随着扫描速率的变化氧化峰电位保持不变。根据Masek 等[24]报道，溶液中的氧化可能是苯环和苯环上的-OH 基团的可逆氧化。在图3b 中，通过观察峰电流与扫描速率的关系可以看出黄素的峰电流ip 与扫速（v1/2）的平方根呈线性关系，并且这个依赖性并没有过原点，表明姜黄素电氧化的过程主要受扩散控制。姜黄素中含有酚羟基，酚羟基的特有的性质是酸性，正因为这个性质才可以保证氧化还原反应的完整。姜黄素的释放过程是一个动态平衡的过程，在阳极电离出氢离子是一个一个失去的，同样在阴极得到的氢离子也是一个一个得到的，正因为这样随着电离的得失构成一个电回路，才能出现氧化还原峰的电位。

图3 a 为姜黄素氧化还原的循环伏安曲线；b 为峰值电流与扫描速率平方根的关系Fig.3 a is the cyclic voltammetry curve of curcumin redox;b is the relationship between the peak current and the square root of the scanning rate

通过循环伏安图研究了姜黄素在不同的静电纺丝膜中的释放动力学，同时做出了三种核/壳结构的静电纺丝膜（如图4a，图4b，图4c）在不同的时间条件下姜黄素的释放情况。随着姜黄素缓慢的释放，姜黄素的氧化峰峰值电流随着时间的增加而增大。将积累释放的百分比通过等式计算出来，根据图2b 的回归方程，在图4d 中做出了姜黄素释放随时间变化的百分比。在图4d 中，可以清楚地看出前10 min 时，姜黄素快速释放，然后释放速度逐渐趋于平缓。其中玉米醇溶蛋白包聚环氧乙烷纤维膜释放速度较快，在10 min 左右可以释放70%，而另两种纤维膜的释放时间逐步释放，10 min 左右时可以释放在50%～60%左右。纤维核中的姜黄素释放要通过两层膜，使它在核内逐步释放了出来，而Zein 是疏水性物质，纤维中姜黄素的释放主要是因为膨胀的玉米醇溶蛋白纤维基质的扩散或渗透，还有一部分原因是纤维基质结构中充满水孔的通道和扩散驱动力。由于聚环氧乙烷的水溶性比较好，在壳中含有聚环氧乙烷的姜黄素可以增加释放的均衡性，使姜黄素在累积上中达到更长时间的释放。核芯中的姜黄素在通过两个壳层后释放到体外使姜黄素达到逐步扩散的效果，因此姜黄素在玉米醇溶蛋白静电纺丝膜中的扩散是受到一定控制的。

图4 不同纤维膜中姜黄素释放的循环伏安图（a、b、c）以及酸性条件下纤维中姜黄素的体外释放曲线（d）Fig.4 Cyclic voltammograms of curcumin release from different fiber membranes (a,b,c) and in vitro release curve of curcumin from fiber under acidic condition (d)

2.4 纤维膜释放前后的扫描电镜图

由图5所示负载姜黄素的玉米醇溶蛋白纤维膜表面比未负载姜黄素的纤维膜表面更加光滑。玉米醇溶蛋白是一种两亲性蛋白质，其一级结构的组成中有三分之二都是疏水性氨基酸残基，因此不易分散于水中。Zein 主要是由α-醇溶蛋白组成，其等电点在pH6.8 附近。在释放姜黄素的48 h 内纤维膜都处于pH3.6 电解液中，使Zein 带正电荷，pH 可能改变了Zein的水合速率和溶胀能力[25−26]，也可能是姜黄素和Zein的相互作用，改变了姜黄素的释放速度。图5（a1～c1）分别是未负载姜黄素、负载姜黄素和姜黄素释放后的纳米纤维，可以看到负载姜黄素后纤维表面会更加光滑，而且经过统计纳米纤维的直径分布的也更加均匀。图5（a3～c3）是姜黄素释放后的纳米纤维膜，姜黄素释放后纳米纤维表面出现孔洞，纤维表面塌陷，甚至纤维之间会出现粘连。此外，Zein 的疏水性延迟了水渗透到纤维膜中的速度，进而延缓了姜黄素的释放。纤维膜中聚合物会出现溶解和溶胀，在一定程度上也会对姜黄素的缓释有很大的贡献。

图5 纤维毡释放前后的扫描电镜Fig.5 Morphology of the scanning electron microscope before and after the release of the fiber mat

2.5 抗菌性

图6a 和图6b 显示了含姜黄素的三种纤维膜和它们的对照组不含姜黄素的纤维膜在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌上的生长曲线，姜黄素抗菌曲线的抑制效率对应图6c 和图6d。由此可以清楚地看出，在OD600的情况下，两种细菌分别培养在三种纤维膜上，细菌在含姜黄素的纤维膜上的生长曲线均比相对应的纤维膜生长的慢，细菌为了适应新的生长环境，在有充足的营养和较少的代谢物的情况下，增殖速度比较快。当生长环境中含有释放出来的姜黄素后，其破坏了细菌的结构，杀死了一部分细菌，这样使同等的情况下的细菌在含有姜黄素的溶液中存活数量较少，原因可能是姜黄素通过引起细胞壁或细胞膜损伤裂解细菌细胞，或者可能是由于某种特定机制对细菌有影响[27]。由图6可知，随着姜黄素释放量的增加，细菌量会被不断地抑制住，三种核壳结构的纤维膜中，相同的时间下三种膜中姜黄素的释放量不同，显然姜黄素释放量最大的时候，细菌的减少数量最多。加入姜黄素后的纤维膜与未加姜黄素的纤维膜对比，细菌生长量均降低表明姜黄素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有优异的抗菌性，并且金黄色葡萄球菌对姜黄素比大肠杆菌更敏感。同轴的纤维膜在用于功能组分缓释方面更持久，表明核壳纤维在释放过程中需要的时间不同，释放的时间越长，持续作用的时间也更长久。

根据图6c 和6d 的抑制效率中观察到相同量的姜黄素，明显看出金黄色葡萄球菌比大肠杆菌的抑制效率高，抗菌活性更好[28]。抗菌效果不同可能是因为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细胞膜组成和结构不同，革兰氏阳性菌外部含有肽聚糖层而革兰氏阴性菌外部含有磷脂膜[29]。姜黄素的抗菌机制是锚定细菌细胞的细胞壁，破坏它，穿透细胞内部，破坏细胞器结构，并通过裂解杀死细胞[30]。

图6 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长曲线（a、c）及抑菌效率（b、d）Fig.6 Growth curves (a,c) and antibacterial efficiency (b,d) of Escherichia coli and Staphylococcus aureus

3 结论

本研究通过同轴静电纺丝制备了三种包埋姜黄素的纳米纤维毡。通过微观形貌观察到壳的直径在80～110 nm 之间，这三种纳米纤维膜通过FTIR 和XRD 分析，证实了姜黄素成功被封装，包埋率达到90%以上。通过循环伏安法测试在溶液中的释放曲线，说明在壳内的姜黄素仍然具有氧化能力，在姜黄素的氧化过程中，通过阳极电流对v1/2和lnv 的方程呈线性关系，说明姜黄素的氧化主要受扩散控制影响。负载姜黄素的三种不同核/壳结构纳米纤维膜在溶液中姜黄素的释放量不同，玉米醇溶蛋白包聚环氧乙烷纤维膜释放速度较快，在10 min 左右可以释放70%，而另两种纤维膜的释放时间逐步释放，10 min左右时可以释放在50%～60%左右。该实验成功将姜黄素包埋在纳米纤维膜中，负载姜黄素的纳米纤维膜具有抗菌作用且姜黄素的缓释延长了抗菌时间，为食品包装和贮藏食品奠定了基础。但静电纺丝负载功能成分的纳米纤维膜在纳米纤维技术从实验阶段到临床应用阶段的过度仍然受到制约，因为静电纺丝技术实现标准化生产仍然有一定的局限性，如控制粗细均一的直径、增加功能成分纳米纤维的稳定性，去除残留有机试剂等。但静电纺丝载功能成分的纳米纤维膜在抗菌以及食品包装材料方面的应用仍然值得去探索。