砂梨石细胞含量多样性及其分级指标

范 净，陈启亮，杨晓平，张靖国，杜 威，胡红菊

（湖北省农业科学院果树茶叶研究所，湖北 武汉 430064）

0 引言

【研究意义】梨（Pyrus. L）是适应性极强的落叶果树，广泛种植于我国南北各地。梨果实脆嫩可口，有生津润肺、止咳化痰的功效，是消费者喜爱的日常必备水果之一。我国是梨属植物的起源中心，种质资源丰富多样。我国梨种质资源的保存量、梨树栽培种植面积产量和梨果消费量均居世界首位[1]。石细胞是木质素沉积在初生细胞壁并在细胞壁次生增厚而形成的，是梨果实特有性状，也是影响梨果实品质的重要因素[2]。砀山酥梨中石细胞密度和聚合度较高是导致砀山酥梨鲜食品质较差的主要原因[3]，库尔勒香梨生产上出现的粗皮果、青头果等品质下降的现象也与石细胞含量增多有密切关系[4]，因此探讨梨种质资源石细胞特性及其遗传变异特点对有效开展梨品质育种具有重要意义。【前人研究进展】国内外关于石细胞研究主要集中在梨果实石细胞形成特点和发育规律分析[5－6]，梨果实石细胞解剖结构和超微结构观察[7－8]，不同品种石细胞含量及木质素含量的分析[3,9－10]，木质素代谢相关基因调控解析[11－12]，石细胞形成过程的细胞程序性死亡调控机制研究[4,13－14]，梨种间不同品种石细胞含量检测分析也有见报道[9]。【本研究切入点】砂梨Pyrus pyrifolia（Burm.）Nakai 作为我国梨属植物栽培种之一，主要分布于我国长江流域及以南的区域，种质资源丰富，但砂梨不同品种的石细胞评价尚不全面，特别是梨种质资源石细胞含量分级指标在砂梨种质资源评价上的应用尤其不足。【拟解决的关键问题】系统全面地分析砂梨种质资源石细胞含量多样性有助于明晰不同种质类型和不同来源的石细胞含量特征，筛选出特异种质资源可用于石细胞代谢机理研究和品质育种，提升种质资源的有效利用效率。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取湖北省农业科学院果树茶叶研究所“国家果树种质武昌砂梨圃”的480份盛果期砂梨种质资源，砂梨树为8～12年生健壮树，栽培管理水平一致。480份不同砂梨种质资源分为地方品种、国外引进品种和国内选育品种（品系），其中国外引进品种和国内选育品种（品系）包括具有砂梨亲缘关系的品种 资源。

1.2 试验方法

2015—2019年，在每个砂梨种质树外围结果枝的东西南北4个方向各取成熟果实10个，再从不同果实上取果肉切块混合，根据四分法每份分成90～110 g 于－20 ℃冷冻，每个品种3次重复。

石细胞含量按聂继云等[15]的方法测定。90～110 g果肉于－20 ℃冷冻24 h，在20 000 r·min－1下匀浆3 min，匀浆后液体倒入1 000 ml玻璃烧杯，加水用玻棒搅拌10 s后静置5 min，倒出上层悬浮物，重复漂洗4次，下层石细胞经滤纸过滤收集后置电热鼓风式烘箱70 ℃烘3 h，干燥石细胞用电子天平进行称量。石细胞含量（%）（Stone cell content，SC）=[称量的石细胞质量（g）/每份样品实际果肉重量（ g）]×100。

1.3 数据分析

采用Excel 2007对480份砂梨种质资源的石细胞含量数据进行平均值统计，并根据不同种质类型和不同来源地分类计算遗传多样性Shannon's信息指数（H′）指数，SPSS 21.0软件对平均石细胞含量数据进行最大值、最小值、变异系数、分布频次和正态分 布分析。

2 结果与分析

2.1 不同砂梨种质资源石细胞含量分析

480份不同砂梨种质资源的石细胞为0.043%～2.748%，分布频次表明石细胞含量呈正偏态分布，70.63%砂梨种质资源石细胞含量集中在0.20%～0.90%（图1）。供试样品的平均石细胞含量0.706%，标准差为0.431，变异系数为61.11%，遗传多样性S hannon's信息指数（H′）为1.95。

图1 480份砂梨种质资源石细胞含量分布频次Fig. 1 Frequency distribution of SC contents of 480 sand pear germplasms

2.2 不同种质类型砂梨石细胞含量多样性分析

按照地方品种、国外引进品种和国内选育品种（品系）的不同种质类型评价480份砂梨石细胞含量变化多样性（表1）。结果显示不同种质类型砂梨平均石细胞含量表现为地方品种（0.886%）＞国外引进品种（0.440%）＞国内选育品种（品系）（0.400%）；变异系数表现为地方品种（48.82%）＞国外引进品种（48.79%）＞国内选育品种（品系）（47.02%）；多样性指数表现为国内选育品种（品系）（2.01）＞国外引进品种（2.00）＞地方品种（1.98）。说明地方品种果实中平均石细胞含量最多，变异系数最高，多样性指数最小；国内选育品种（品系）果实中平均石 细胞含量最少，变异系数最低，多样性指数最大。

表1 不同种质类型砂梨石细胞的多样性评价Table 1 Diversity of sand pear germplasms based on SC content

2.3 地方品种不同来源砂梨石细胞含量多样性分析

299份地方砂梨品种以不同来源地分析遗传多样性，结果显示地方品种不同省份来源的砂梨平均石细胞含量表现为云南（1.239%）＞四川（1.091%）＞贵州（0.966%）＞湖南（0.905%）＞湖北（0.865%）＞广东（0.820%）＞广西（0.812%）＞福建（0.620%）＞江西（0.612%）＞浙江（0.595%）；变异系数表现为云南（51.07%）＞湖北（49.92%）＞四川（46.46%）＞贵州（39.03%）＞湖南（30.85%）＞广西（27.31%）＞福建（26.80%）＞江西（21.81%）＞浙江（21.35%）＞广东（14.02%）；多样性指数表现为四川（1.90）＞贵州（1.88）＞湖北（1.82）＞云南（1.64）＞湖南（1.63）＞福建（1.56）＞广西（1.49）＞江西（1.25）=浙江（1.25）＞广东（0.95）。说明来自云南地方品种的平均石细胞含量最多和变异系数最高，四川地方品种的多样性指数最大；浙江地方品种的平均石细胞含量最少，广东地方品种的变异系数最低且多样 性指数最小（表2）。

表2 地方品种不同省份的石细胞含量多样性评价Table 2 SC content-based diversity of sand pear germplasms from different provinces in China

2.4 国外引进品种和国内选育品种（品系）不同来源的石细胞含量多样性分析

国外引进的砂梨品种主要是来源于日本和韩国，日本品种的平均石细胞含量和多样性指数均高于韩国品种，韩国品种的变异系数大于日本品种（表3）。国内选育品种（品系）平均石细胞含量表现为西南地区（0.483%）＞华中地区（0.393%）＞华东地区（0.372%）；变异系数表现为西南地区（57.67%）＞华东地区（49.34%）＞华中地区（43.41%）；多样性指数表现为华中地区（2.04）＞华东地区（1.94）＞西南地区（1.78）（表3）。说明来自我国西南地区的选育品种平均石细胞含量最多和变异系数最高但多样性指数最小；华东地区选育品种平均石细胞含量 最少，华中地区变异系数最低但多样性指数最大。

表3 国外引进品种不同国家和国内选育品种不同区域的石细胞含量多样性评价Table 3 SC content-based diversity of cultivars from foreign countries and those selected for breeding from regions in China

2.5 砂梨石细胞含量分级指标比较

按照梨种质资源石细胞含量分级与指标[16]，480份供试砂梨样品的石细胞含量分为5级，其中极多（SC≥0.8%）的资源有158份，占样品量的32.92%。砂梨石细胞含量的平均值0.706%和中位数0.635归为石细胞含量多（0.5%≤SC＜0.8%）的范围。采用梨种质资源石细胞含量分级指标对砂梨石细胞含量进行分级，明显表现为向石细胞含量多的偏离（表4）。基于本研究中的480份砂梨种质资源石细胞含量为正偏态（Skewness=1.3）和中位数为0.635的特点，在级差为0.2水平的等差分级和级差为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5的梯度差将砂梨石细胞含量分为7级指标（表4），对比梨种质资源石细胞含量分级指标，砂梨石细胞等差分级和梯度差分级的7级指标都将不同种质资源离散分布在不同级别，其中砂梨石细胞梯度差分级指标评价的种质资源分布更接近正态分布。基于此提出优化的砂梨石细胞含量评价7级梯度差分级指标。

表4 砂梨石细胞含量分级指标比较Table 4 Grading standards for sand pear germplasms based on SC content

按照优化的砂梨石细胞含量评价7级梯度差分级指标，供试的480份砂梨石细胞资源分为极少15份、少22份、较少81份、中153份、较多141份、多47份和极多21份，占比分别为3.12%、4.58%、16.88%、31.88%、29.37%、9.79%和4.38%。15份石细胞含量极少的资源包括国内选育品种（品系）8份，如‘翠冠’（0.043%）、‘青魁’（0.052%）、‘苏翠1号’（0.063%）等；国外引进品种7份，如‘万丰’（0.052%）、‘丰水’（0.053%）、‘圆黄’（0.059%）等。

3 讨论与结论

本研究中砂梨石细胞含量的平均值为0.706%，大于曹玉芬等[9]对89份砂梨品种石细胞含量平均值0.552%。可能是因为供试样品的地方品种较多，占供试样品的62.29%，地方品种的平均石细胞含量0.868%，大于480份砂梨石细胞含量的平均值。部分砂梨品种在湖北武汉检测得到的石细胞含量与辽宁兴城的检测结果有所不同，比如曹玉芬等[9]检测‘雪峰’ ‘满顶雪梨’ ‘清香’的石细胞含量分别为0.256%、0.298%和0.147%，而在本试验中这3个品种的石细胞含量分别为0.181%、0.202%和0.271%，这可能是因为同一品种在果实生长发育过程中石细胞积累受环境或气候的影响而造成的差异。‘库尔勒香梨’果实发育过程中石细胞与细胞凋亡的相关研究也表明，在细胞分化旺盛期的梨果实发育早期，木质素沉积受树体营养和环境因素的影响，部分细胞凋亡或分化形成石细胞积累[4]。

不同种质类型石细胞含量的多样性分析表明，国内选育品种（品系）和国外引进品种的平均石细胞含量变低，说明人工选育过程中石细胞含量被驯化改良而减少，石细胞含量的性状是梨驯化过程中的功能缺失性突变[17]。地方品种的多样性指数小可能是因为供试地方品种62.54%样品平均石细胞含量集中在0.661%～1.075%，而国内选育品种的多样性指数大，可能是因为品质改良过程中不仅减少了石细胞的含量，还丰富了选育品种的遗传背景，导致国内选育品种多样性丰富度高于地方品种。

地方品种不同省份石细胞含量多样性分析表明，西南地区的云南、贵州和四川的平均石细胞含量、变异系数和多样性指数高于其他省份，可能是因为中国砂梨品种起源于长江流域及其以南地区野生的砂梨[18]，西南地区的地方品种可能多是来源于该地的野生砂梨的驯化。国内选育品种石细胞含量多样性分析表明，中国华东地区和华中地区的选育品种石细胞含量低于西南地区。西南地区选育品种石细胞含量相对较高，可能是该地区选育品种大多是地方品种‘金花梨’实生选育而来，金花梨石细胞含量为0.942%，按照本研究中优化的分级评价指标，金花梨石细胞含量属于较多级别，以金花梨为亲本选育的后代虽然在石细胞含量上有一定的减少，但是遗传背景单一改良程度不明显。国外引进的砂梨品种多数是日本和韩国的选育品种，日本引进品种平均石细胞含量较高，韩国引进品种多样性指数最小，可能是因为日本和韩国的选育品种多是以‘二十世纪’培育而来[19]，品种同质化严重。

种质资源的分级指标是种质资源鉴定评价描述规范化和标准化的基础，但是梨种质资源石细胞含量分级指标应用于砂梨石细胞含量的性状评价时资源分布情况近似负偏态，不能很好地表现资源分布的离散情况，不利于砂梨石细胞含量的性状优异资源筛选。石细胞含量性状为数量性状，当样本量足够大时可以代表某一群体的变异情况，本研究中砂梨资源480份基本可以代表该群体的遗传多样性，因此根据砂梨资源石细胞含量数据优化的分级指标是可靠的，比较砂梨石细胞含量等差分级和梯度差分级的7级指标，采用砂梨石细胞7级梯度差分级指标进行评价，砂梨种质资源石细胞含量性状在各级的分布离散比例更接近正态分布。

按照本研究优化的7级梯度差分级指标，筛选出的优异种质资源将为种质资源有效利用提供直接的材料支撑。梨杂交后代果实石细胞含量性状遗传倾向研究表明，杂交后代向石细胞多的方向遗传力较强，后代石细胞含量呈增多趋势，以石细胞少为育种目标时最好选择石细胞含量少的资源为亲本[20]。本研究中筛选出的石细胞含量极少（SC＜0.1%）的‘翠冠’ ‘苏翠1号’ ‘丰水’ ‘日光’ ‘幸水’ ‘万丰’ ‘新一’等种质资源可以作为优异亲本用于砂梨石细胞性状改良。不同石细胞含量品种可用于遗传群体构建和石细胞检测方法的创新，Xue等[21]利用不同石细胞含量的品种开发出石细胞数字图像的扫描评价程序，应用该系统可以定量评价石细胞的数量、大小、面积和密度。石细胞含量极少和极多的种质资源可用于木质素代谢的研究，在梨木质素代谢的研究中，研究者通过30份低石细胞含量和30份高石细胞含量不同梨品种的Pbrmir397a启动子区DNA多态性分析，进一步阐明Pbrmir397a是通过抑制木质素生物合成关键酶漆酶（LAC）基因来调节梨果实石细胞发育过程中的木质素代谢[22]。Wang等[23]以2份不同石细胞含量的秋子梨为研究材料，分析木质素在果实发育过程中的沉积，酚类代谢产物变化和木质素合成基因的表达，揭示了木质素在果实发育过程中代谢的分子机制。

本研究对480份不同种质类型和不同来源的砂梨种质资源石细胞含量性状进行遗传多样性分析，砂梨石细胞含量性状遗传多样性丰富，地方品种的平均石细胞含量最高，国内选育品种（品系）遗传多样性指数最大。在砂梨石细胞含量性状评价基础上优化石细胞含量分级指标，建立砂梨石细胞含量评价的7级梯度差分级指标。筛选出的不同石细胞含量的特异种质资源可用于梨优良品种改良和木质素代谢调控的研究，提升种质资源的利用效率。