玉米dhn1和dhn2基因渗入普通自交系的分子标记辅助选择研究

潘金卫， 邓 磊， 王 伟， 杨文鹏， 任 洪， 柏光晓

(1.贵州大学农学院， 贵阳 550025； 2.贵州省农业科学院旱粮研究所， 贵阳 550006)

玉米是世界上主要的饲料和粮食作物，其生长发育受到各种环境因素的影响。其中干旱是影响玉米生长的主要限制因素。中国是水资源十分短缺的国家之一，干旱、半干旱耕地面积占总面积的52.5%[1]，每年受旱面积达2.0×107～2.7×107hm2，平均每年玉米因干旱而造成的产量损失达15%～20%[2]。在我国西南地区，春旱和伏旱较为严重[3]，而玉米散粉吐丝期需水量较大，伏旱是导致减产最主要的因子之一。

为提高玉米的耐旱性，人们在耐旱基因表达[4]、耐旱相关基因的克隆及功能鉴定等方面做了大量的研究工作[5]，分离和鉴定了耐旱相关的一些候选基因及蛋白[6]，并对相关基因进行了遗传转化[7]。Mao等[8]在玉米第10染色体上的GRMZM2G127379(ZmNAC111)基因上游572 bp处启动子区发掘一个82 bp的MITE插入位点，普遍存在于温带玉米种质中，而热带玉米种质中缺失，并且证明与玉米苗期耐旱性有关。Wang等[9]发掘ZmVPP1基因组中的遗传变异，并证明可以有效提高玉米苗期的耐旱性。玉米的耐旱性由数量性状位点(QTL，Quantitative Trait Locus)控制[10]，目前，定位的耐旱QTLs涉及形态学性状[11]、产量性状及其产量构成因子[12]、开花-吐丝间隔期(ASI)[13]等，以及在干旱胁迫下可能产生遗传变异的一些生理生化性状[14]。 脱水素(dehydrin，DHN)是LEA蛋白(late embriogenesis abundant protein,LEA)中的一类，它具有较强的亲水性，在植物响应非生物逆境环境如干旱、低温冻害、高盐碱等胁迫过程中起着重要的作用[15]。玉米中与脱水素有关的DHN基因有8个(http://www.maizegdb.org/)，对干旱胁迫处理表现出不同程度的响应，其中，Zmdhn1和Zmdhn2基因在玉米各个组织中均有稳定表达[16-18]，通过调控DHN基因的表达，可以显著提高植物的抗逆性。Liu等[19]根据dhn1中的单核苷酸A/G多态性，开发了CAPS 标记dhnC 397，可以用于玉米的耐旱评估。这些研究均为利用分子标记辅助选择玉米耐旱种质提供了可能。

为进一步拓宽玉米耐旱性种质资源，本研究以引进的玉米耐旱材料和普通玉米自交系为试材，利用常规育种和分子标记辅助选择技术，将耐旱主效基因dhn1与dhn2渗入到普通玉米材料中，以期获得玉米耐旱性种质，为玉米抗旱育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料与群体构建

以2份引自CIMMYT的玉米耐旱材料，3份普通玉米自交系为试材，具体见表1。

利用耐旱性玉米材料和普通玉米自交系杂交获得F1，用普通自交系回交获得BC1F1，在BC1F1世代于盛花期进行人工混合授粉(每个基础群体混粉约50个单株)获得BC1F1/S1，共构建6个回交群体：CML 538/QR 273//QR 273、 CML 538/PH 6 WC//PH 6 WC、CML 538/LX 9801//LX 9801、CML 539/QR 273//QR 273、CML 539/PH 6 WC//PH 6 WC、CML 538/LX 9801//LX 9801。

1.2 分子标记

对于耐旱dhn1基因，参照柳思思等[20]开发的功能性CAPS分子标记dhnC 397进行检测，其中dhn1基因序列397位点发生了G与A的转换，PCR扩增产物经StyI酶切后，含有G位点的目的片段被酶切成131 bp和33 bp两个片段，而含有A位点的由于缺少StyI酶切识别位点，因此不能被酶切，不被酶切的大片段与玉米的耐旱性关联，被酶切的小片段与玉米的不耐旱性关联。对于耐旱dhn2基因，选用与dhn2连锁的SSR标记umc 1634进行检测(表2)。

表2 耐旱基因及分子标记信息

1.3 DNA提取及PCR扩增

采用分子标记辅助选择的玉米微量DNA分离提取的CTAB法提取DNA[21]。用超微量紫外分光光度计(NanoDropTMOne/OneC，产地美国)检测DNA的浓度与质量，将DNA样品浓度稀释至10 ng·μL-1，-20 ℃下保存。

注：M为DL 2000 Marker；a为CML 538；b为CML 539；1为QR 273；2为PH 6 WC；3为LX 9801。图1 dhn1和dhn2目的基因标记在亲本之间的多态性Fig.1 Polymorphism of markers for dhn1 and dhn2 between parents

注：1为供体亲本CML 538；2为轮回亲本QR 273；3为3～32为世代群体的扩增条带。图2 利用umc 1634标记在玉米BC1F1/S1世代中部分单株扩增结果Fig.2 Amplification of some single plants in maize BC1F1/S1 generation by umc 1634 marker

PCR扩增反应体系(10 μL)：模板DNA 3 μL，10×Buffer 1 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)1 μL，Glycerol(99%)1 μL，dNTP(2 mmol·L-1)0.75 μL，Primer(F+R)1.2 μL(5 μmol·L-1)，Taq(5 U·μL-1)0.075 μL，最后补ddH2O至10 μL。PCR扩增程序在BIO-RAD C 1 000Thermal Cycler型扩增仪上进行。PCR扩增程序为：93 ℃预变性1 min；93 ℃变性1 min，58 ℃退火2 min，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。针对dhn1基因，PCR反应程序参照柳思思[20]的操作方法，PCR产物，利用限制性内切酶StyI进行酶切，温度为37 ℃，时间为4 h。用8%聚丙烯酰胺凝胶，对PCR产物进行检测。

1.4 靶基因选择与背景分析

对BC1F1/S1分离世代，于苗期提取的基因组DNA，利用CAPS标记dhnC 397，和SSR标记umc 1634进行靶基因选择。对获得的中选株系，用40对SSR标记(参考标准NY/T 1432-2014)进行遗传背景分析。用于靶基因选择和背景分析的SSR标记引物的序列来源Maizegdb网站(http://www.MaizEgdb.org/)，由上海捷瑞生物工程公司合成。

1.5 萌发期的耐旱性鉴定

参照《玉米抗旱性鉴定技术规范》(DB 13/T 1282—2010)选取整齐一致、颗粒饱满、无破损的玉米种子进行萌发期的抗旱鉴定。每份材料选取25粒，共3次重复。

1.6 统计分析

理论背景回复率计算公式：E[G(g)]=1-(1/2)g+1；基于分子标记的背景回复率计算公式：G(g)=[L+X(g)]/2L[22-23]，式中G(g)为在g代的遗传背景回复率；g为用于回交的世代次数；L为参与分析的分子标记数量；X(g)为回交g代中表现为与轮回亲本相同带型标记的数量。用Microsoft Excel 2010软件和SPSS 23软件对相关数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 多态性引物筛选

利用CAPS标记dhnC 397和SSR标记umc1634对供试材料进行多态性筛选。结果表明，在dhn1位点，PH 6 WC的PCR扩增产物可被StyI酶切，表明PH 6 WC在dhn1位点不具有耐旱性，而CML 538、CML 539、QR 273、和LX 9801在dhn1位点的PCR扩增产物不能被StyI酶切，表明这些自交系在dhn1位点具有耐旱性。在dhn2位点，连锁标记umc 1634在CML 538、QR 273、PH 6 WC和LX 9801的扩增产物均有多态，CML 539与PH 6 WC、QR 237和LX 9801的扩增产物均有多态(图1)。

2.2 靶基因选择结果

在BC1F1/S1分离世代，于苗期利用CAPS标记dhnC 397和SSR标记umc 1634进行靶基因选择(图2)。构建的6个群体共586个单株，共中选了56个单株，根据田间植株表现，最终收获22份株系。以PH 6 WC为轮回亲本的2个群体，中选24个单株，实际收获8株；以QR 273为轮回亲本的2个群体，中选19个单株，实际收获7株；以LX 9081为轮回亲本的2个群体，中选13个单株，实际收获7株，其中获得渗入dhn1基因的株系共1份，编号为NH 13；同时渗入dhn1与dhn2基因的株系共2份，编号为NH 4和NH 16；其余19个株系都渗入了dhn2基因(表3)。后继续种植收获的22份株系自交加代直至稳定。

注：a为CML 538；b为CML 539；1为PH 6 WC；2为QR 273；3为LX 9801。图3 部分SSR标记在亲本间多态性的筛选Fig.3 Screening of polymorphism among parents with partial SSR markers

表3 BC1F1/S1世代目标基因选择结果

2.3 遗传背景分析结果

用40对SSR标记对获得的稳定株系进行遗传背景分析(表4)。结果表明，各群体收获材料的背景回复率介于72.5%～92.5%之间，平均值为82.78%，CML 538/PH 6 WC//PH 6 WC群体最高，达到84%，比理论值高9%；CML 539/PH 6 WC//PH 6 WC群体最低，为81.17%，比理论值高6.17%。在22份材料中，除了CML 538/LX 9801//LX 9801群体的NH 15，遗传背景回复率为72.5%，低于理论背景回复率75%，其余都高于75%，最高为CML 538/PH 6 WC//PH 6 WC群体的NH 4，高达92.5%；最低为CML 538/LX 9801//LX 9801群体的NH 9，低至72.5%。

表4 22份材料背景回复率简单统计

2.4 中选材料的耐旱性鉴定

参考DB 13/T 1282-2010标准，在渗透压为-0.50 MPa的PEG-6000干旱胁迫下，对22份材料进行萌发期的耐旱性鉴定。结果表明，种子萌发生长明显受到抑制，对照组和实验组种子最终萌发率存在极显著差异(p<0.01)。22份材料的耐旱指数介于45.54%～71.07%之间，耐旱指数最高的为NH 17，高达71.07%；最低为NH 2，低至45.54%，其中，4份材料为弱耐旱型，17份材料为中等耐旱型，1份材料为强耐旱型(表5)。NH 4与NH 16同时渗入耐旱dhn1和dhn2基因，耐旱指数分别为61.23%和67.05%，明显高于同一群体的其他收获材料，说明耐旱基因dhn1和dhn2同时渗入时，对耐旱性具有一定累加作用。

表5 22份材料萌发期的耐旱性鉴定结果

3 结论与讨论

本研究以引进的耐旱性玉米材料作为供体，与普通玉米自交系作为受体构建了6个回交群体，利用MAS进行靶基因选择，将耐旱主效基因渗入普通玉米自交系中，共获得22份材料，根据萌发期的初步抗旱鉴定，18份材料达到中等及以上耐旱性，可以为玉米抗旱育种提供材料支撑。

为提高玉米耐旱性，Ribaut等[24]使用分子标记辅助育种，将玉米开花吐丝间隔期较短的耐旱供体Ac 7643中5个ASL QTLs，通过回交转育渗入到优良热带干旱敏感受体CML 247中，获得了开花吐丝间隔期较短的玉米材料。柳思思[20]利用CAPS功能标记dhnC 397，对210份自交系进行分子筛选，结果证明，138份材料具有抗旱性，与210份自交系基本抗旱信息一致。Liu等[25]通过对热带和温带地区的368个玉米品种候选基因进行关联分析，找到了与玉米抗旱有关的基因ZmDREB，通过回交导入与分子辅助等方法，进一步证明该基因的表达可以增强玉米的耐旱能力。耐旱主效基因或是调控基因对耐旱的强弱具有决定性作用[26]。本研究利用MAS技术，将耐旱性主效QTL(或基因)dhn1与dhn2渗入普通玉米自交系中，经耐旱性鉴定，获得的18份中等及以上耐旱性材料，对耐旱玉米的分子改良具有参考作用。

种子萌发期模拟干旱处理是耐旱性鉴定的常用方法。郭效龙等[27]以抗旱性较强的玉米自交系郑58和不抗旱自交系E 28为试材，利用不同浓度PEG-6000水溶液在萌发期模拟干旱胁迫，结果表明，郑58的种子萌发率、萌发耐旱指数均高于E 28。贾凯旋等[28]以河北省推广面积较大的37个玉米品种为试验材料，采用渗透压为-0.4 MPa的PEG-6000溶液在萌发期模拟干旱胁迫，通过萌发指数进行分级，获得强抗耐旱型及以上的品种10份。姚玉波等[29]以35份玉米自交系为试验材料，采用渗透压为-0.4 MPa的PEG-6000溶液模拟干旱胁迫，与对照组比较，种子最终萌发率存在极显著差异，通过对萌发指数的分析，鉴定出抗旱型材料4份。本研究参考DB 13/T 1282-2010标准，在渗透压为-0.50 MPa的PEG-6000干旱胁迫下，对中选的22份材料进行萌发期的抗旱鉴定，与前人研究结果一致，但由于选取的处理浓度(渗透势为-0.50 MPa)较高，因此本实验耐旱指数研究结果与之相比偏低，导致抗旱类型划分略有差异。玉米耐旱性是由多种数量性状和质量性状复合遗传因子组成，十分复杂，在创制耐旱种质时，不但要考虑耐旱主效QTL位点(或基因)的分子标记检测的准确性，还应考虑对获得的中选株系进行耐旱性鉴定，二者结合起来，才能获得更准确的耐旱性种质。