丹霞地貌铁皮石斛及其人工繁育苗性状比较分析

包英华，韩 伟，张自斌

（1. 韶关学院英东生物与农业学院，广东 韶关 512005；2. 广西壮族自治区农业科学院花卉研究所，广西 南宁 530007）

0 引言

【研究意义】铁皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）为兰科多年生草本植物，具益胃生津，滋阴清热功效，治疗阴伤津亏、胃阴不足、阴虚火旺和目暗不明病症[1]。铁皮石斛对生境要求苛刻，自然繁殖率极低，加之环境的破坏，使得野生资源濒临灭绝[2,3]。丹霞地貌铁皮石斛生长于广东省韶关市东北部“丹霞地貌”的悬崖上，其茎为紫红色；叶片紫绿色，茎和叶片多斑点，叶鞘脉紫红色；节不显著；花黄绿色，唇瓣具紫红色点状斑块。由于丹霞地貌铁皮石斛不断被采挖，其野生资源逐渐减少，处于濒危边缘，笔者利用植物组织培养技术已成功建立其人工繁育苗培育体系[4]，对丹霞地貌铁皮石斛的合理有效利用和可持续发展提供技术保障。比较分析丹霞地貌铁皮石斛与人工繁育苗的性状显微特征及多糖含量研究，以探明丹霞地貌铁皮石斛在人工繁育和栽培过程中是否发生品质变化，而且对丹霞地貌铁皮石斛资源的开发利用和人工繁育苗的质量标准制定具有重要意义。【前人研究进展】关于野生铁皮石斛资源与人工繁育苗的研究报道较少。黄民权等[5]研究表明，铁皮石斛愈伤组织与原植物多糖含量、单糖化学组成及其对白细胞抑制指数具相似性。范俊安等[6]发现，三年生铁皮石斛组培品与野生品的形态相似，组织结构基本相同，总多糖含量差异不显著。黎万奎等[7]研究结果表明，人工栽培铁皮石斛和野生铁皮枫斗总多糖含量相近，原球茎组织中总多糖含量最低，胶囊中多糖含量最高。付涛等[8]通过测定仿野生铁皮石斛与组培苗根茎叶中的挥发性成分，发现其差异很大。【本研究切入点】目前，人工繁育铁皮石斛种苗技术较成熟，但人工繁育苗与野生苗的性状显微特征和有效成分含量有无存在差异，很少有相关报道。【拟解决的关键问题】本研究分别以丹霞地貌铁皮石斛和人工繁育苗的2年生和3年生茎作为试验材料，分析其性状显微特征和多糖含量变化，比较分析丹霞地貌铁皮石斛与人工繁育苗的性状显微结构特征的差异性和多糖的组织化学定位及含量测定，为其伪品鉴定和铁皮石斛种内鉴别奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

丹霞地貌铁皮石斛（若干）采自于广东韶关（24°72′28″N，113°57′98″E），生长状态良好；人工繁育铁皮石斛苗（若干）采自于韶关学院生态园（24°46′48″N，113°39′25″E），生长状态良好。茎鲜 条经50 ℃烘干，粉碎，60目过筛获得粉末。

1.2 形态特征分析法

丹霞地貌铁皮石斛株高采用直尺测量，茎直径、节间长度、节长度、叶片长度和宽度等采用游标卡尺测量。每个样品平行测量15份[4]。采用SPSS 25.0对 试验数据进行统计分析。

1.3 显微特征分析法

采用徒手切片法，制作样品鲜茎和粉末切片，番红-固绿复染后观察分析其显微结构特征[4]。用schiff 试剂配方2法[9]，对样品多糖颗粒进行组织化学定位。每种材料用3组样品，每组样品做5个切片，每个切片随机观察3个视野，各项测量指标共获得135个测量数据[4]。采用SPSS 25.0对试验数据进行统计分析。

利用形态分析系统（Image Measuring Software）对图片进行拍摄和测量，图片像素分辨率规格不同时，换算出其倍率，进行测量，因此中图片均未附加 标尺。

1.4 多糖含量测定方法

采用《中华人民共和国药典》2015版法，测定样品多糖含量[1]。回归方程Y=11.57X+0.21（R2=0.966，n=5），葡萄糖在3.0～65.0 μg·L-1线性关系良好；稳定性试验表明显色在4 h内稳定；RSD为0.33%，符 合测定要求。

2 结果与分析

2.1 丹霞地貌铁皮石斛和人工繁育苗的形态特征分析

丹霞地貌铁皮石斛的茎呈紫红色，叶为深紫绿色，节间长度不明显（图1-1，图1-2）；但人工繁育苗的茎则呈深绿色，叶为浅绿色，节间长度明显（图1-3，图1-4）。人工繁育苗的茎直径明显比丹霞地貌铁皮石斛苗粗，见表1。丹霞地貌铁皮石斛的株高、茎直径、节间长度、叶片长度和宽度与人工繁育苗之间存在显著差异，见表1。但丹霞地貌铁皮石斛的2年生茎和3年生茎之间株高、茎直径、节间长度等指标无显著差异；除了株高外，人工繁育苗的2年生茎和3年生茎之间茎直径、节间长度等指标也无显著差异。

图1 丹霞地貌铁皮石斛和人工繁育苗的形态特征Fig. 1 Morphology of propagated and wild D. officinale plants from areas of Danxia landform

表1 丹霞地貌铁皮石斛和人工繁育苗的形态特征分析Table 1 Morphology of propagated and wild D. officinale plants from areas of Danxia landform

2.2 丹霞地貌铁皮石斛和人工繁育苗的茎显微结构特征分析

铁皮石斛茎组织构造由角质层、表皮、皮下层细胞与基本组织、维管束组成。角质层被复染后呈橘黄色；表皮细胞是扁平的一层细胞，排列较紧密，属于不均匀加厚型，外壁及侧壁稍增厚，微木化，草酸钙针晶束多见于近表皮细胞处；皮下层细胞一般1～3列，细胞大小不一、形状各异；基本组织细胞呈多角形，其间分布散生的外韧型维管束，维管束外围排列具厚壁的鞘纤维（图2）。

图2 丹霞地貌铁皮石斛和人工繁育苗茎显微结构特征Fig. 2 Microstructures of propagated and wild D. officinale plants from areas of Danxia landform

从表2可知，丹霞地貌铁皮石斛与人工繁育苗的10种茎显微结构均存在显著性差异。其中丹霞地貌铁皮石斛3年生茎的角质层厚度（10.85 μm）、表皮细胞直径（22.23 μm）、鞘纤维直径（0.66 μm）、维管束直径（15.22 μm）、鞘纤维数目（171.53个）、木质部厚度（38.88 μm）和韧皮部厚度（44.12 μm）等指标均大于其他样品；维管束数目（54.4个）在2年生丹霞地貌铁皮石斛中最多；皮下层细胞层数（2.02个）和皮下层细胞直径（39.84 μm）在3年生人工繁育苗中较大。

表2 丹霞地貌铁皮石斛和人工繁育苗的茎显微结构特征比较分析Table 2 Microstructures of stems of propagated and wild D. officinale plants from areas of Danxia landform

在丹霞地貌铁皮石斛和人工繁育苗茎粉末中均可检测出草酸钙针晶，形状为沿一方向成束紧凑排列，中间宽，两端逐渐变窄成针尖状（图3）；草酸钙针晶直径在丹霞地貌铁皮石斛和人工繁育苗间无显著差异；但长度间具有显著差异，其中2年生人工繁育苗的最长，可达70.13 μm，2年生丹霞地貌铁皮石斛的最短，是52.25 μm（表3）。

从图3可见，粉末导管为螺纹或网纹状。导管直径在2年生和3年生丹霞地貌铁皮石斛之间无显著差异，与人工繁育苗间具显著差异，3年生人工繁育苗的导管直径最大，可达13.85 μm（表3）。

丹霞地貌铁皮石斛和人工繁育苗的茎粉末淀粉粒直径间无显著差异（表3）。淀粉粒多为单粒、部分为复粒形式存在。单粒淀粉粒呈类圆形或椭圆形或多半圆形状，脐点不明显，层纹隐约可见；而复粒淀粉粒中，大小相近的单粒聚合呈直线状、或大小不相同的单粒聚合、或三粒或四粒单粒聚合形成复粒现象，少见五粒以上的单粒聚合现象，虽颗粒较小但颗粒分明；复粒层纹较为清晰，脐点均不太明显（图3）。

粉末木薄壁细胞排列紧密且整齐，多为长梭形（如五边形，六边形），细胞壁具增厚现象，木化，细胞直径间具显著差异（图3）。2年生丹霞地貌铁皮石斛的木薄壁细胞直径最大，可达59.08 μm，3年生丹霞地貌铁皮石斛、2年生和3年生人工繁育苗依次变小，3年生人工繁育苗的仅为34.01 μm（表3）。

粉末维管束鞘细胞多数成纺锤形，少数长六边形（图3）。鞘细胞壁厚度在2年生和3年生丹霞地貌铁皮石斛之间无显著差异，与人工繁育苗间具显著差异，3年生人工繁育苗的细胞壁厚度最厚，可达6.39 μm（表3）。

表3 丹霞地貌铁皮石斛和人工繁育苗茎粉末显微结构特征比较分析Table 3 Microstructures of powdered stems of propagated and wild D. officinale plants from areas of Danxia landform

图3 丹霞地貌铁皮石斛和人工繁育苗茎粉末显微结构特征Fig. 3 Microstructures of powdered stem of propagated and wild D. officinale plants from areas of Danxia landform

2.3 丹霞地貌铁皮石斛和人工繁育苗茎多糖颗粒的组织化学定位与总含量分析

茎组织化学定位结果表明，丹霞地貌铁皮石斛和人工繁育苗茎的基本组织中分布着大量多糖颗粒，呈较深的紫红色，为小块聚集状或颗粒状，在表皮细胞与维管束内少有分布。丹霞地貌铁皮石斛相比，人工繁育苗的多糖颗粒主要呈小块聚集状，被染色程度会更明显。丹霞地貌铁皮石斛茎多糖颗粒直径与人工繁育苗多糖颗粒直径间存在显著差异，但2年生和3年生丹霞地貌铁皮石斛多糖颗粒直径间无显著差异；其中3年生人工繁育苗茎多糖颗粒直径最大，可达28.61 μm（图4、表4）。

图4 丹霞地貌铁皮石斛和人工繁育苗茎多糖组织化学定位Fig. 4 Histochemical localization of polysaccharides in stems of propagated and wild D. officinale plants from areas of Danxia landform

丹霞地貌铁皮石斛和人工繁育苗茎的总多糖含量间具显著差异。丹霞地貌铁皮石斛的总多糖含量高于人工繁育苗，2年生和3年生丹霞地貌铁皮石斛的总多糖含量分别高达35.46%和32.37%（表4）。

表4 丹霞地貌铁皮石斛和人工繁育苗茎多糖的组织化学定位与含量分析Table 4 Histochemical localization and polysaccharide content in stems of propagated and wild D. officinale plants from areas of Danxia landform

3 讨论与结论

铁皮石斛具有较高的药用和保健作用，市场需求量大。由于铁皮石斛野生资源紧缺，药材基源复杂，导致商品药材混乱[10−11]。本研究结果显示，丹霞地貌铁皮石斛和人工繁育苗在性状特征上充分反映出其遗传变异。丹霞地貌铁皮石斛的茎颜色为紫红色，叶为深紫绿色；人工繁育苗的茎为深绿色，叶为浅绿色；人工繁育苗的株高、茎直径、节间长度、叶片长、宽度均比丹霞地貌铁皮石斛大，说明这些性状特征均可作为鉴别丹霞地貌铁皮石斛和其人工繁育苗甚至不同居群铁皮石斛的鉴定和评价指标。

显微构造分析结果表明，丹霞地貌铁皮石斛与人工繁育苗鲜茎的10种显微结构指标均存在显著差异，为两者的鉴别提供依据。2年生与3年生人工繁育苗的维管束直径和韧皮部厚度间无显著差异，说明人工繁育苗从异养生长逐渐变为自养生长，输导系统的发育在栽培后的2～3年内变化小，但栽培时间的延长，输导系统的结构有何变化，有待于进一步研究。茎粉末中的草酸钙针晶成束排列，导管为螺纹或网纹状，淀粉粒多为单粒、部分为复粒；这与秦文等[12]研究结果相吻合。木薄壁细胞排列紧密，长梭形，细胞壁具增厚现象，木化；维管束鞘细胞多为纺锤形。草酸钙针晶长度、导管直径、木薄壁细胞直径、维管束鞘细胞厚度等显微特征对丹霞地貌铁皮石斛与人工繁育苗间具显著差异，可作为其鉴别特征。

利用组织化学技术在药用植物有效成分（多糖、生物碱、黄酮、香豆素和皂苷等）的分布规律和动态变化等方面研究发挥越来越重要的作用[9,13−14]。组织化学定位方法能够快速而简单地观察和分析出，丹霞地貌铁皮石斛与人工繁育苗茎多糖颗粒的分布特征。多糖颗粒集中分布在基本组织中，表皮细胞和维管束内少有分布。多糖颗粒直径在丹霞地貌铁皮石斛茎与人工繁育苗间存在显著差异，可作为其鉴别特征。

在铁皮石斛糖类成分中，可溶性多糖具有一定的生理活性，也是评价铁皮石斛品质的重要指标。本研究结果表明，2年生和3年生丹霞地貌铁皮石斛的总多糖含量分别可达35.46%、32.37%，这与龚庆芳等[15]研究结果基本一致，达到《中华人民共和国药典》（2015版）[1]中以无水葡萄糖为标准，标定铁皮石斛多糖含量不少于25.0%的水平。但人工繁育苗的总多糖含量未达药典要求水平。试验结果初步说明，丹霞地貌铁皮石斛大规模种植应以原生境仿野生栽培为佳，这不仅保持丹霞地貌铁皮石斛固有的形态特征，也可保证其总多糖含量的稳定性。