高温蒸汽对蚕卵微粒子病感染防治的研究探索

王霞，黄旭华，王平阳，张雨丽，崔秋英，唐亮，黄深惠，蒋满贵*

（1.广西壮族自治区蚕业技术推广站，南宁市 530007；2.广西壮族自治区蚕业科学研究院，南宁市 530007）

微孢子虫是一类专性寄生细胞的单细胞真核生物，家蚕微孢子虫（Nosema bombycis，Nb）是一类寄生于家蚕细胞的微粒子病病原体［1］。蚕种检疫是控制微粒子病大面积暴发的重要手段，而家蚕微孢子虫是家蚕成品卵检疫的唯一对象。微孢子虫在家蚕体内可通过蚕座及蚕室环境中存在病原而造成水平传播，以及经过胚种传播两种方式进行传播，超过允许标准的带毒蚕种需要整批淘汰，这常会给蚕种生产企业造成巨大损失，是蚕业生产稳定发展的制约因素［2-3］。

防治家蚕微粒子病是蚕业生产的重点和难点。为了减少家蚕微孢子虫病造成的经济损失，蚕种微孢子虫的检验检疫对减少蚕业生产的经济损失具有关键作用。国内外学者为了开发灵敏度高、特异性强、可行性强和成本低的检测方法，对微粒子病进行了大量的探索性试验研究［4-8］。在诊断技术方面，开发了包括应用染色技术、分子生物学技术、免疫学技术等方法诊断家蚕微孢子虫病；在防治技术方面，主要是采用化学方法和物理方法来防治家蚕微粒子病，以防为主，防治结合。“防”主要是加强检验检疫，将病原源头控制住；“治”主要有化学防治和物理防治。化学防治主要是应用化学药物进行消毒和治疗，针对家蚕微粒子病的消毒防病和药物治病等手段，药物消毒能够使病原微生物的蛋白质变性而使其失去致病力［9］，而药物治疗则是利用药物的特异性来阻断微孢子虫原虫增殖以达到治疗该病的效果［10-11］。在物理防治技术上，研究者们也进行了大量的探索性试验。物理防治主要包括温汤浴种法、高温即浸法及热空气处理法等［8］。研究发现温汤浴种法和高温即浸法（此处的高温是相对于家蚕生理适温24～28 ℃而言，设置为45～47 ℃）都可以对微粒子病起到防治作用。温汤浴种法始于清代广东地区的“浴水法预防微粒子病”。陈启沅［12］将之记录于《蚕桑谱》。高温即浸法是将蚕卵浸泡于45～47 ℃的盐酸处理一定时间后，利用盐酸对蚕卵内微孢子病原的消杀作用，从而减少其发病［13-15］。家蚕微孢子虫病是对蚕业生产危害最严重的病害之一，因此，对家蚕微孢子虫病进行诊断治疗对蚕业生产尤为重要。本试验研究用高温蒸汽处理蚕种后对家蚕微孢子虫病的防治效果和对蚕卵孵化率的影响，以期为家蚕微粒子病的防控提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 供试病原与家蚕

两广二号、7 湘和9 芙等蚕种由广西蚕业技术推广站提供。将7 湘原种和9 芙原种对交产下16 h 后的蚕卵用高温蒸汽处理，之后进行浸酸、催青、孵化和调查处理。家蚕微孢子虫Nb 由广西蚕业技术推广站蚕病室提供，微孢子配制成1×107mL-1微孢子虫悬液备用。

1.2 仪器

家蚕微粒子病热疗仪，由广西蚕业技术推广站与广西大革农业科技有限公司联合研制。

2 试验方法

2.1 家蚕添食微孢子虫

两广二号（CK）、7湘（原种）与9芙（原种）蚕种正常催青后饲养，在5龄起蚕后通过桑叶添食微孢子虫孢子（每头5 龄蚕添食10 μL 1×107mL-1微孢子虫悬液），待家蚕食下后，用正常桑叶饲养，正常结茧化蛹、出蛾单卵圈制种、镜检。两广二号不作添食，正常上蔟结茧后调查茧层率、产卵量等数据。

2.2 高温蒸汽处理蚕卵

将产下后的每个单蛾卵圈分成两份，其中半个卵圈使用家蚕微粒子病热疗仪处理，分别在45 ℃、46 ℃、47 ℃、48 ℃、49 ℃的蒸汽下处理10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min（每个处理组均设3 个重复）后，常温放置至产卵后20 h。另外半个蛾卵圈作为对照直接放置到产卵后20 h。随后处理组和对照组均按常规方式浸酸5 min后催青，待收蚁后，每区随机取60头蚁蚕进行单头镜检，调查数据，统计蚕卵微孢子相对防治效果及蚕卵孵化率。将家蚕正常饲养，待结茧化蛹后，调查茧重、茧层率及产卵量数据。技术路线如图1所示。

图1 技术路线

2.3 数据分析

相对防治效果统计［16］：在出蚁后逐头检测蚁蚕的微孢子感染情况，计算其相对防治效果，相对防治效果（%）=（1－处理组检出率/对照组检出率）×100。

试验数据生物统计：由GraphPad Prism 8.0 软件统计分析。

3 结果与分析

3.1 高温蒸汽处理对家蚕微孢子虫的杀灭效果

在5龄起蚕通过桑叶添食微孢子虫悬液，正常饲养，单蛾卵圈制种后，对蚕卵进行高温蒸汽处理。结果表明经过不同温度处理后，整体表现为高温杀灭微孢子虫的效果比对照组好，即温度越高，相对防治效果越好；处理时间越长，相对防治效果越好（图2）。在45 ℃和49 ℃条件下，杀灭效果随处理时间延长而增强，49 ℃条件下的杀灭效果整体比45 ℃条件下的效果好；在46 ℃、47 ℃和48 ℃条件下，短期内杀灭效果随处理时间延长而增强，在30 min 左右达到阈值（图2）。综合分析，在47～48 ℃条件下处理30～40 min对蚕卵微孢子的相对防治效果最好。

图2 不同温度下不同处理时间对蚁蚕微孢子虫相对防治效果

3.2 高温蒸汽处理对蚕卵孵化率的影响

经高温蒸汽处理后的蚕卵，进行催青并统计孵化率以探讨高温蒸汽处理对家蚕蚕卵孵化率的影响。结果表明，在45～47 ℃处理条件下，不同处理时间的试验组之间蚕卵的孵化率无显著差异，与对照组的蚕卵孵化率相比，差异不显著（图3），说明该条件对蚕卵正常发育无影响。然而在48 ℃和49 ℃处理条件下，蚕卵孵化率随处理时间延长而降低，说明处理时间较短时对蚕卵发育无显著影响，但是处理时间较长时显著影响蚕卵的生长发育（图3）。结合高温蒸汽对微孢子虫的杀灭效果，认为47 ℃处理30 min是最优组合。

图3 不同温度下不同处理时间对蚕卵孵化率的影响

3.3 高温蒸汽处理蚕卵对其后续的茧重、茧层率、产卵量等影响

将高温蒸汽处理后的蚕卵催青孵化，并在温度为28 ℃和湿度为85%的条件下正常饲养，统计转青时间、茧重、茧层率、产卵量等指标，以探讨高温蒸汽处理对家蚕性状的影响。结果表明，高温蒸汽处理对家蚕催青有影响，其中对照组的转青时间为8 d，45～47 ℃处理组转青时间为9 d，48 ℃处理组转青时间为10 d；49 ℃处理组转青时间达到11 d。正常饲养47 ℃处理30 min的家蚕和对照组的家蚕，调查茧重、茧层率、产卵量等数据，分析该处理对经济性状的影响。结果表明优选组合与对照组相比，茧重、茧层率、产卵量等经济指标均无显著差异（图4）。表明47 ℃高温蒸汽处理蚕卵30 min可以在不影响家蚕正常发育和经济指标的前提下，高效杀灭微孢子虫，在一定程度上达到防控家蚕微粒子病的目的。

图4 家蚕茧重、茧层率、产卵量调查结果

4 讨论

由于微孢子虫对宿主可产生严重的危害，显著影响宿主群体的正常生长发育，且具有较高致死率，对我国畜牧业、水产养殖业等造成巨大的损失。微孢子虫能够引发家蚕微粒子病，对蚕业生产造成毁灭性的危害，可通过饲养环境及野外昆虫交叉感染，也可继代感染［17］。刑东旭等［15］通过试验说明利用高温即浸处理感染微孢子虫的蚕卵可以有效的防控微孢子虫的胚种传染。王璐［16］也证明，当家蚕卵龄为20 h 时，于高温48 ℃下在浓度为1.075 g/mL 的盐酸中浸酸6 min可以有效防治蚕卵微粒子病。刑东旭［15］和王璐［16］均推测高温即浸是通过灭活蚕卵内的微孢子虫裂殖体，而非抑制微孢子虫增殖的方法，达到防控微孢子虫的继代传染的目的。基于这些研究，本研究采用高温蒸汽浴处理感染微孢子虫的家蚕卵，通过催青孵化逐头检测蚁蚕，统计各处理条件对家蚕微孢子虫感染的防治效果，来检测通过高温蒸汽法能否达到同样的防治微孢子虫效果。结果显示，高温处理后蚕卵的转青时间与对照组略有差异，普通蚕卵转青时间为8 d，45～47 ℃处理组转青时间为9 d，48 ℃处理组转青时间为10 d；49 ℃处理组转青时间达到11 d；46 ℃以下温度处理40 min 以内对家蚕蚕卵孵化率及其经济性状无影响，但对蚕卵微孢子虫防治效果差；47～49 ℃处理30～40 min 时蚁蚕微孢子虫相对防治效果达到90%以上，但在48～49 ℃温度条件下，随着处理时间的延长，蚕卵孵化率有逐渐降低的趋势，说明48～49 ℃的蒸汽处理对蚕卵的发育有一定的抑制作用，不仅影响蚕卵孵化率，同时也影响后期家蚕的蚕体生命力及其经济价值。综合本试验中蚕卵微孢子虫的相对防治效果和蚕卵孵化率两个研究结果，得出47 ℃高温蒸汽处理30 min为最优组合，该组合虽然对蚕卵的转青时长有些影响，但其对蚕卵的孵化率及其后期饲养家蚕的经济性状与对照组相比无显著差异，无抑制作用，而且对蚕卵期的微孢子虫感染的防治效果相对显著。后续将增加感病对照组以及其他品种的的试验结果研究，使得试验设计得更加完善及严谨，后期将把试验结果应用于生产中，检验此方法是否适用于生产实践。