鸡柔嫩艾美耳球虫丝氨酸羟甲基转移酶DNA疫苗免疫保护效果研究

2021-07-14包梦莹邹志萱樊慧琴黄媛媛王佃云刘立恒

中兽医学杂志 2021年4期

包梦莹，邹志萱，樊慧琴，黄媛媛，王佃云，刘立恒

（江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌 330045）

危害养鸡业的胞内寄生性原虫病，呈世界范围分布，发病率高达50%～70%，死亡率为20%～30%，严重者可达80%[1～2]。传统的抗球虫药物和活疫苗控制方法有其自身的局限性和不足[3]。本实验通过使丝氨酸羟甲基转移酶表达纯化，将DNA苗通过肌肉注射进入鸡只体内，分析结果，检测该DNA疫苗的抗柔嫩艾美耳的能力，为新型抗球虫疫苗的开发提供参考。

1 材料

1.1 实验动物

健康的1日龄海兰褐蛋公鸡，将其饲养在经甲醛和高锰酸钾熏蒸严格消毒，高温火枪烘烤、高压水枪冲洗的鸡舍，以保证雏鸡生活环境为健康无球虫环境。所用饲料中均不含有任何抗球虫药物，鸡只饲养至14日龄备用。

1.2 基因工程疫苗

pVAX 1.0-丝氨酸羟甲基转移酶DNA，pVAX 1.0-空质粒，-20℃下保存备用。

2 实验方法

2.1 DNA疫苗质粒大量提取与纯化

将带有重组质粒的宿主菌取出，取200μL加入到含有卡那霉素的LB培养基中复苏过夜。次日继续用1000mL新鲜LB培养基进行扩大培养，12000 rpm离心10min收集沉淀，放入-4℃保存。后采用大提质粒法大量提取DNA疫苗（具体流程参考分子生物学实验指导）。

2.2 试验设计

饲养于无球虫环境之中的1日海兰褐蛋公鸡，试验组鸡共分为4组，其中每组雏鸡30羽，进行随机分组，分为感染非免疫组（红对照组，攻虫，不免疫，注射TE）、非感染非免疫组（白对照组，不攻虫、不免疫，注射TE）、pVAX 1.0-丝氨酸羟甲基转移酶DNA组（注射DNA疫苗，攻虫）以及pVAX 1.0-空质粒组（注射空质粒，攻虫）。14日龄首免：鸡只腿部肌肉注射200μl pVAX -丝氨酸羟甲基转移酶DNA质粒/只。红对照组和白对照组注射同体积TE缓冲液。一周后二免，每只鸡腿部肌肉注射200μL pVAX-丝氨酸羟甲基转移酶DNA疫苗。红对照组和白对照组注射同体积TE缓冲液。二免后第14天，对照组和试验组鸡只经口接种柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊1×105个/只。在攻虫后第7天，称重、扑杀鸡只后，取盲肠用于盲肠病变计分和克盲肠卵囊计数。

3 检测指标

3.1 OPG的计算

按照麦克马斯特法（McMaster’s method）计算OPG（克肠卵囊值）。克盲肠内容物卵囊减少率（%）=（感染对照组卵囊数-各组卵囊数）/感染对照组卵囊数×100%。

按角田清[4]的方法对盲肠内容物中卵囊数（OPG）与卵囊值进行转换。

3.2 存活率

存活率=（试验结束时存活鸡只羽数/试验组鸡只羽数）×100%

3.3 相对增重率

相对增重率=（试验组增重率/非感染非免疫组增重率）×100%

3.4 抗球虫指数（ACI）

ACI=（存活率+相对增重率）-（病变值+卵囊值)

3.5 对小肠进行盲肠病变计分

病变值为最终宰杀鸡后通过盲肠情况来反映各组实验对象的病变情况，通过各组实验对象的病变值来判断实验过程中是否发生交叉感染。

3.6 统计学分析

试验结果采用SPSS 17.0软件统计分析，采用Student-Newman-Keuls Test进行差异显著性分析，P＜0.05为差异显著具有统计学意义。

4 实验结果

根据体重增加、存活率、病变评分、卵囊减少率和抗球虫指数（ACI）评价pVAX载体-670DNA疫苗的保护作用。试验证明：鸡球虫的攻毒量，DNA疫苗注射途径，鸡的生长环境以及其他客观因素都可能影响实验结果；基因工程疫苗是时代的新方向，是值得深入探究的一个领域，每一次实验都是一次宝贵的经历；完成动物试验后，可进行血清抗原抗体检测，肌肉蛋白表达检测等进一步的探索实验，使实验更具条理性。见表1。